《核酸研究进展》PPT课件.ppt

核酸研究进展,内容简介,核酸的发现和研究概貌 核酸基础 基因组与基因组学 核酸结构与结构预测,核酸的发现和研究工作进展,1868年 Fredric Miescher从脓细胞中提取“核素”1944年 Avery等人肺炎球菌转化试验1952年Hershey等噬菌体转化试验，1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构1958 Crick提出的中心法则1968年 Nirenberg发现遗传密码1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法1985年 Mullis发明PCR 技术1990年 美国启动人类基因组计划(HGP)1994年 中国人类基因组计划启动2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架后基因时代,核酸基础,核酸的分子结构 DNA的结构 RNA的结构,DNA的结构,DNA的一级结构 DNA的二级结构 DNA的三级结构,DNA的一级结构,概念：DNA的一级结构是指DNA分子中脱氧核苷酸的排列顺序。不同的DNA分子（或片段）其一级结构不同，即脱氧核苷酸排列顺序不同，也就是碱基排列顺序不同。意义：遗传信息基本结构单位：脱氧核糖核苷酸连接键：3，5磷酸二酯键阅读方向：从5 端到3 端,DNA序列分析(DNA sequencing),双脱氧链终止法 Sanger DNA的自动测序 DNA化学降解法 MaxamGilbert,DNA序列分析简单回顾,DNA测序方法两位科学家的发明起了决定性作用：第一位是Frederick Sanger，1977年发明的DNA测序方法。第二位是Leroy Hood和同事Michael Hunkapiller及Lloyd Smith在1986年对Sanger的方法作了改进。Hood的发明自动测序仪。首先用荧光方法取代了放射方法，然后采用激光和电脑来自动读取测序结果。第一台自动测序仪由Applied Biosystems公司制造成功，一天能够产出4,800个DNA序列碱基。今天，市场上的测序仪仍然采用这种设计。今天已经趋向于采用毛细管阵列电泳（capillaries arrays electrophoresis）技术。Applied Biosystems的毛细阵列电泳DNA分析仪3730 xl能够并行处理96孔板，一天可测出大约200万碱基。,一个长达数十年的专利申请也许会重写发明DNA自动测序仪的历史。据美国科学杂志报道，位于纽约的一家小型生物技术公司Enzo Biochem，1982年，申请DNA自动测序专利。今年11月中旬，美国专利和商标局裁定：Enzo Biochem的这项技术含有与1998年授予加州理工学院前任生物学家黎若伊胡德和同事的发明专利相同的发明。胡德等的这项专利为加州理工学院拥有，该技术目前支撑着70亿美元的DNA测序工业。Enzo经过律师数十年不懈努力赢得这个专利。位于加州福斯特城的应用生物系统公司（Applied Biosystem）是购买的胡德专利，在2006年公司测序仪的收入为5.4亿美元，加州理工学院因此专利而每年拥有数百万美元的版税收入。专利和商标局的决定让加州理工学院和应用生物系统公司的财务状态处于危险之中。双方就谁是技术的第一发明者争执不已，答案还有待实验室的记录本和日程表公布之后才会出现。,双脱氧链终止法,双脱氧链终止法,DNA的自动测序,DNA自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,DNA自动测序结果举例,DNA化学降解法,基本步骤:(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。,真核生物基因组结构特点,1）真核生物细胞内有两份同源的基因组。2）真核细胞结构基因基因转录产物为单顺反子。3）大量重复序列：高度重复序列：106次，包括卫星DNA、反向重复序列和较复杂的重复单位组成的重复序列；中度重复序列可达103104次，如Alu家族，KpnI，Hinf家族，以及编码区序列如rRNA基因、tRNA基因、组蛋白基因等；单拷贝或低度重复序列整个基因组中只出现一次或很少几次的核苷酸序列，主要是编码蛋白质的结构基因。4）间隔序列(intervening sequences)，内含子(intron)。5）具有许多复制起点，每个复制子的长度较小。,原核生物基因组结构特点,基因组较小,形式多样，可能是DNA，也可能是RNA，可能是单链的，也可能是双链的，可能是闭环分子，也可能是线性分子；细菌染色体基因组则常为环状双链DNA分子。功能相关的结构基因常常串连在一起，并转录在同一个mRNA分子中，称为多顺反子。DNA分子绝大部分用于编码蛋白质，间隔区通常包含控制基因顺序。基因重叠是病毒基因组的结构特点。除真核细胞病毒外，基因是连续的，不含内含子序列。,DNA的二级结构,Watson和Crick双螺旋结构模型 DNA结构的多态性,Watson和Crick双螺旋结构模型,DNA双螺旋结构的多态性,B-DNA与Z-DNA的比较,比较内容 B-DNA Z-DNA螺旋手性 右旋 左旋螺旋周期的核苷酸数目 10 12螺旋直径 20A 18A碱基平面的间距 3.4A 3.7A螺距 34A 45A相邻碱基对间的转角36A 60A轴心与碱基的关系 穿过碱基对 不穿过碱基对,B-DNA结构参数,性质 X射线衍射分析 STM分析螺旋的手性 右旋 右旋螺旋的旋转周期 33.8A*34.4+2A(32-36A)大沟 宽度 11.7A*间距:22.6A 深度 8.5A 7A小沟 宽度 5.7A 间距:12A 深度 7.5A 2A大沟和小沟有关值的比较 宽度比2.2 间距比1.88,DNA双螺旋结构的多态性,在生理盐溶液中92%相对湿度下是B型双螺旋。在钾离子相对湿度为75%时，DNA分子是A构象。一般说来，AT丰富的DNA片段常呈BDNA。用乙醇沉淀法纯化DNA时，DNA由B-DNA经C-DNA，最终变为A-DNA。若DNA双链中一条链被相应的RNA链所替换，会变成ADNA。当DNA处于转录状态时，DNA模板链与由它转录的RNA链间形成的双链就是ADNA。BDNA双链都被RNA链所取代而得到由两条RNA链组成的双螺旋结构也是ADNA。由此可见A-DNA对基因表达有重要意义。除A-DNA、B-DNA螺旋外，还存在B-DNA、C-DNA、D-DNA等。总之，DNA的双螺旋结构处于动态平衡中。,DNA结构的多态性,很多研究证明，DNA不仅可以是双螺旋，也可以是三螺旋，还可以是千奇百怪的折叠弯曲。目前已经发现DNA至少有9种特殊结构，而且随着研究的深入，发现DNA的结构还会增多。相对于现有的经典双螺旋DNA结构，其他DNA结构也许处于非主流地位。DNA结构的多样性对人类认识人和生物的多样性，以及生命现象的多样性具有关键作用，至少有助于人类治疗疾病、开发新药以及理解生命的本质。,反向重复序列(inverted repeats),回 文 序 列,富含A/T的序列,在高等生物中，A+T与GC的含量差不多相等，然而在它们的染色体某一区域，AT含量可能相当高。在很多有重要调节功能的DNA区段都富含AT，特别是在复制起点和启动子的TATA框的序列中，其对于复制和起始十分重要。因为AT对只有二条氢键，此处的双链较GC对处易于解开，有利于起始复合物的形成。,嘌呤和嘧啶的排列顺序,考察相邻的二核苷酸对，发现碱基组成相同，但嘌呤和嘧啶的排列顺序不同，双螺旋的稳定性具有显著的差异。例如5GC3,3CG5和5GC3,3GC5，前者的稳定性远大于后者。它们的氢键数目是相同的，它们的差别在于相邻碱基之间堆积力不同。即从嘌呤到嘧啶的方向的碱基堆积作用显著地大于同样组成的嘧啶到嘌呤方向的碱基堆集作用。这是因为前者的嘌呤环和嘧啶环重迭面积大于后者的嘧啶环和嘌呤环的重迭面积，这在B型DNA中确是如此。,三螺旋,1957年Davies等首次根据试验结果提出三螺旋核酸的概念。70年代初，Arrnott等根据X射线衍射结果，建立了三螺旋核酸简单分子模型。三螺旋DNA的结构单元是三碱基体，有两种基本类型：一种是嘧啶-嘌呤-嘧啶型三碱基体(Py-型)；另一种则是嘌呤-嘌呤-嘧啶三碱基体(Pu型)。1987年irkin等在酸性溶液的质粒中发现-型三螺旋，1987年ervan等通过将第三股粘接到天然上。结果表明，三螺旋的形成可能伴随于转录、复制和重组等细胞过程。,三螺旋DNA不是DNA在自然态下的主要结构，而是在特定的条件下形成的。它是由一条ODN通过与双链DNA形成Hoogsteen键或反Hoogsteen键，在其大沟处紧密缠绕而成。具体就是富含嘧啶的ODN与双链DNA的富含嘌呤的链以平行的方式键合，形成Hoogsteen键；富含嘌呤的ODN与双链DNA的富含嘌呤的链以反平行的方式键合，形成反Hoogsteen键。,Hoogsteen键或反Hoogsteen键的形成只是构筑三螺旋的必要条件；要想使三螺旋具备一定的生物学功能，实现它的实际应用，还必须保证它具有一定的稳定性。影响三螺旋DNA稳定性的因素可分为内部因素和外部因素两方面。内部因素主要是指链长、碱基序列组成、骨架本性等因素。这些因素主要是通过影响第三条链键合时碱基配合的强度、氢键相互作用的强度以及双链受体重排时的能量大小来影响所形成的三螺旋的稳定性的。碱基错配对三螺旋稳定性的影响很大。影响三链核酸稳定性的外界因素主要包括溶液的pH值、溶液中阳离子的浓度、配基结合作用力的大小等。,“嘧啶型”或嘧啶-嘌呤-嘧啶（YRY）型三螺旋,Arnott等提出的三螺旋为A型DNA，糖环构象是N型（C3-endo），一个周期含有12个核苷酸，平均碱基高度为32.6nm，有较负的X位移（-32nm）。Howard等根据红外光谱及偏端霉素A的嵌入实验提出YRY型构象上采取B型，其糖环构象是C2-endo（S型），3条核苷酸链都有相同的糖-磷酸主链构象。在两个反平行的T链间存在一个二重对称轴。d(T)nd(A)nd(T)n的B型结构比A型在能量上更优越，同时Raghunathan等给出了B型三螺旋结构模型的初始坐标。分子模型和振动谱的研究表明在d(G)nd(G)nd(C)n和d(G)nd(A)nd(T)n三螺旋中，S型和N型糖环构象都存在，糖环的二面角在anti区。d(C)n链是S型，Watson-Crick中的d(G)n链是N型。然而，三螺旋究竟是A型还是B型或者是两者的混合体还需要进一步实验去证实。,“嘌呤型”或嘌呤-嘌呤-嘧啶型（RRY）三螺旋中，第三条嘌呤链以反平行于Watson-Crick双螺旋嘌呤链的方向缠绕到双螺旋的大沟上，专一性地与嘌呤链结合。早期，在利用光谱学和超分离测量方法探索三链复合物时发现了GGC和IIC两种RRY型三螺旋。后来，Fresco等用亲和色谱法确认RRY型三螺旋中也包括AAUI、IAUT和IGC三螺旋。随后，又确认了GGC、AGC和TAT 3种典型的RRY型三螺旋，以及CAT、AGC和TCG等相互作用较弱的三螺旋。研究发现RRY型三螺旋（CAT、AGC和AAT等）第三条嘌呤链和Watson-Crick双螺旋的嘌呤链以两个反-Hoogsteen氢键相连接，且糖环的二面角限制在anti区。核磁共振研究RRY型内含一个TCG三碱基体,分子内三链DNA,分子内三链DNA是由一条单链通过自身回析形成的，其结构中含有两个loop环，为了满足形成过程中对极性以及碱基配对的要求，这条单链必须具有特殊的序列，即其序列要具有镜像重复性（mirror repeat）.例如，对PyPuPy型三链，两条嘧啶链相对于中间的嘌呤链来说具有镜像对称的关系。由于分子内三链的各条链都位于同一分子内，所以与分子间三链相比，它更易于形成。,H-DNA,H-DNA又称铰链DNA，1987年由Mirkin等在一种持粒的酸性溶液中首次发现。H-DNA可在任何以镜象重复的寡聚核苷酸中产生（核苷酸序列具有H回文结构）。H-DNA是由部分未缠绕的复合DNA中的一个富嘧啶链，经回折同复合体中伸展的富嘌呤链间形成Hoogsteen氢键而形成的分子内三螺旋，即DNA的双链所形成的三链螺旋。由于形成过程中发生CC+的转化，故称H-DNA。并把这类序列称为H回文序列。,H-DNA,研究还发现在毫摩尔级的Mg2+和中性pH下，d(G)30d(C)30所形成一种由GGC三碱基体组成的嘌呤分子内三螺旋结构（H*-DNA），而另外一些研究则发现d(AG)nd(T)n和d(G)nd(C)n束道也能形成同时含有H-DNA和H*-DNA的纽结（nodule）三锭结构。在这个DNA结构中，两个三螺旋的顶端含有少数几个未配对的DNA碱基，而且由于不同结构间存在大量的链节，因此，纽结DNA的形成具有较高的成核能，但延伸能较低（因为单链区较少）。,R-DNA,Lacks 1996年曾提出了一种三碱基体，其中第三条链上的碱基不仅与双螺旋嘌呤链上的碱基相互作用，同时也与第一条链上的嘧啶碱基相互作用。Zhurkin等在研究活体的基因重组时又提出了这种不同于YRY和RRY型三螺旋的三链复合物。近年来发现在RecA核蛋白纤维内接合处有三链复合体并作为同源重组的中间体，这种三链复合物被称为R-DNA。第三条链定义为R链，和双螺旋中的一条链（W-链）相同且平行。在这三螺旋中。对应三碱基体的第三条链上的碱基位置靠近双螺旋Watson-Crick碱基对的二重轴；从而与另外两个碱基都发生相互作用。同时R-链上每一个碱基的电荷分布严格与W-C碱基对大沟上的碱基电荷电性互补，同源序列的相互识别可能是通过互补的静电相互作用进行的，即含有静电识别密码。,三螺旋的稳定性,核苷酸结构:寡聚核苷酸序列的组成和长度溶液条件,三螺旋的检测,紫外-可见分光光度法:三螺旋解链和双螺旋解链的两个转变温度可作为三螺旋形成的标准荧光分析法许多荧光染料不仅可用于检测双螺旋，也可用于检测三螺旋，从双螺旋向三螺旋转变的过程会诱导荧光强度下降，可用于检测三链的形成原子力显微技术原子力显微镜可以直接观察吸附在云母和金表面上的，根据的宽度和高度来判定三螺旋是否形成。,三链DNA的应用,60年代，人们对DNA、RNA以及DNARNA的杂台三螺旋结构进行了广泛的研究。Morgen等(1968)首先研究了RNA作为第3条链，在体外大肠杆菌体系中三螺旋的形成对转录的抑制作用。Moser等(1987)证明在5 端携带EDTA Fe()的寡聚核苷酸可以导致双螺旋特定位点的断裂，产生类似限制性酶的作用，但催化效率远远比不上真实的体内限制性酶。,三螺旋DNA作为生物的分子工具,通过特定位点的切割和诱导突变可以操纵基因，有助于我们研究基因图谱和基因功能。三螺旋DNA可以作为基因调节剂。当形成三螺旋的寡聚核苷酸(简称TF0)结合到一个靶基因上能够阻止RNA的转录，抑制靶基因的表达。三螺旋DNA战略优势在于它能够利用TFO直接结合到基因上来抑制基因表达，而不必结合到mRNA上，也就是说，三螺旋DNA可以直接在转录过程而不必到翻译过程起作用。,在细胞体系的生物化学方面的研究,三螺旋DNA的研究在细胞体系的生物化学方面已经取得了初步进展。c myc致癌基因在真核细胞生长和繁殖的调节过程中起着重要的作用。C-myc基困的过度表达与多种恶性肿瘤有关。最初在核细胞中的转录抑制研究表明，TFO能降低c-myc基因的转录。Postel等(1991)研究表明，在细胞体系的生理pH值和温度下也能产生同样的效果。最近的研究还证明，TFO可以抑制人类免疫缺乏病毒(HIv)基因组的表达。,反义寡核苷酸类药物,是应用反义寡核苷酸类药物通过WastonCrick碱基配对与细胞内核酸(DNA或认)特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平抑制特定基因表达的技术。反义寡聚核苷酸(ASO)技术是用单链RNA 或DNA 来改变mRNA的新陈代谢从而调节从基因到蛋白质的信息。ASO可结台到靶基因上而不影响其它基因，这一特点使得ASO 成为了解蛋白质生物功能的一个有利工具。反义RNA比反义DNA长得多，而且有不止一个结合位点，可能还会产生非专一性序列的作用 反义DNA在细胞液中更稳定屿，但它的作用是瞬时的。,义寡核苷酸类药物的机制,反义寡核苷酸与靶mRNA结合形成DNA-RNA杂合分子，可以激活RNase H，该酶可以切割杂合分子中的RNA链，导致靶mRNA降解。不能激活RNase H活性的反义寡核苷酸可以通过空间位阻效应阻止核糖体结合来抑制靶mRNA的翻译ASODN的作用是在DNA结合蛋白（如甲基化酶、激活子、限制性内切酶等）的识别位点处，通过与靶基因结合形成三螺旋，并且位点专一性地干扰DNA和蛋白的结合、激活子的转录起始或转录延伸等，进而阻止基因转录和复制。可以通过封闭剪接位点，从而纠正错误的剪接。,反义寡核苷酸技术应用,l967年就提出了利用与转录RNA互补的寡聚核苷酸来调节基因表达的设想1978年在体外研究劳氏肉瘤病毒基因特定位点的抑制时，此设想才得到证实(Zamecnik等，1978)。在人类骨髓细胞的白血病细胞系HL一60中由载体产生的ASO结合到cmyc先导序列的单链片断上使得cmyc的转录水平降低。cmyc转录的降低遣成HL6O细胞中单核白血球不同且抑制了它的繁殖速度。为人类疾病在基因水平进行治疗的战略手段。目前，已有近10种抗肿瘤反义药物已经完成了实验研究，正在进行I-期临床实验.,ASODN的作用特点是：,(1)缩短新药的研发周期，降低新药的研发成本。(2)具有高度的特异性。ASODN是疾病蛋白基因为靶点，针对疾病蛋白表达的某一特定过程进行阻断，因此具有高度特异性。(3)在真核细胞中具有内源性。,AS0DN的给药系统,脂质体载体脂质乳制剂纳米球及微球载体树枝状高聚物凝胶制剂,ASODN改性,1）ASODN的化学改性作用，通过ASODN进行化学改性，如在ASODN的3-末端连接上化学切割试剂、乙二胺四乙酸、二价铁离子或邻菲罗琳的衍生物，在改性过程中需要铜离子和还原剂的存在，可实现对靶基因进行诱导切割等不可逆的反应，从而导致靶基因的失活。克服了细胞内限制性内切酶对未改性ASODN的快速水解作用，延长了ASODN在细胞内的半衰期；2）ASODN的3末端和5末端可以采用许多封端基因来改性。,反义核酸,硫代磷酸酯寡核苷酸 第一代反义核酸杂合型反义核酸 第二代反义核酸肽核酸 第三代反义核酸。,硫代寡核苷酸（phosphorothioate oligonucleotides，S-ONs）,S-ONs是比较成熟、应用最广泛的寡核苷酸。该结构中磷酸二酯键的未结合氧原子被硫原子取代，可以提高对核酸酶的抗性。天然结构的寡核苷酸（phosphodiester oligonucleotides，PO-ONs）,混合骨架寡核苷酸（mixed-backbone oligonucleotides，MBO）,MBO是继S-ONs后的第二代寡核苷酸。MBO在不同的位置上包含不同的修饰，通常由天然DNA、含硫代磷酸酯的DNA、2-O-甲基RNA和2-O-烯丙基RNA中的两种或两种以上组合而成。2-O-甲基RNA在MBO中的位置与MBO的性质密切相关，将它置于3或5端的修饰稳定性显著优于S-ONs。MBO减少了硫代磷酸二酯的数量，降低了由硫代引起的副效应，2-O-甲基RNA/mRNA的双链亲和力增强，保留的硫代磷酸二酯键仍起到了抗核酸酶的作用。,肽核酸(peptide nucleic acid，PNA),是一种以中性酰胺键为骨架并兼有多肽和核酸性质的独特化合物，是一类新型的核酸类似物，由于其独特的理化性质、杂交特性以及对基因转录和翻译的调控作用，在分子生物学研究、肿瘤和传染性疾病基因治疗等方面均显示出较为广阔的应用前景,PNA的分子结构,PNA是由丹麦科学家Nielsen于1991年首先合成的，其经典的分子结构是由重复性的N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元通过酰胺键相连取代DNA分子中的磷酸二酯键骨架所形成的一种DNA分子的类似物，其嘌呤和嘧啶碱基则通过亚甲基羰基连接在甘氨酸的氮原子上。,肽核酸特点（peptide nucleic acids，PNA）,1.与核酸的杂交能力强于核酸间的杂交能力；2.热稳定性高于核酸间的杂交体；3.抗酶解能力增强，由于其非肽和非核酸的结构特点，蛋白酶和核酸酶均不能降解PNA。,肽核酸,PNA的理化性质,PNA的结构使其具有以下特点：对核酸具有特异性识别能力，因不带电而避免了PNA与阴性的DNA或RNA的静电排斥；可用化学合成法在其N末端或C末端连上PNA寡聚体、报告基团、金属黏合剂及某些插入基团；具有高度生物稳定性，不易被核酸酶、多肽酶及蛋白酶降解；无手性，无需对映体纯化。,PNA具备了独特的杂交性质：,(1)由于PNA骨架结构呈电中性，当其与互补的靶核酸序列交时不受静电排斥作用的影响，所形成的PNADNA或PNA-RNA杂交分子比天然杂交分子具有更高稳定性。(2)PNA的另一杂交特性是杂活性几乎不受介质盐浓度的影响，在低盐浓度条件下，PNA与靶序列DNA或RNA杂交还有利于消除二级结构对杂交效率的影响。(3)PNA 以序列特异性的方式与互补的DNA 或RNA分子杂交，PNA既可以采取反向平行互补结合方式，也可以采取正向平行互补结合方式与其靶序列杂交，但以反向平行互补结合方式为主。(4)PNA-DNA杂交比DNADNA杂交更易受碱基错配的影响，PNA-DNA碱基错配杂交体分子的不稳定性比DNA-DNA碱基错配杂交体分子的不稳定性高,(3)PNA 以序列特异性的方式与互补的DNA 或RNA分子杂交，PNA既可以采取反向平行互补结合方式，也可以采取正向平行互补结合方式与其靶序列杂交，但以反向平行互补结合方式为主。(4)PNA-DNA杂交比DNADNA杂交更易受碱基错配的影响，PNA-DNA碱基错配杂交体分子的不稳定性比DNA-DNA碱基错配杂交体分子的不稳定性高,Gowers等通过实验证实了DNA三螺旋在含有很多嘧啶间隔的靶位点能形成并通过胞嘧啶的质子化进行稳定的三螺旋结构。根据三螺旋结构具有这种功能，科学地研制出了一种对核酸酶的稳定性和膜透性都有提高的新型DNA模拟物肽核酸（peptide nucleic acid.PNA）。PNA与互补的DNA或RNA结合具有高度专一性，具备与靶基因形成二聚体的能力。,PNA对基因表达的调节作用,1.PNA对转录过程的调节作用2.PNA对翻译过程的调节作用3.PNA抑制逆转录调节基因的表达,PNA的应用,PNA在分子生物学研究中的应用PNA在杂交技术中作为探针的应用PNA在PCR技术中的应用即“PCR夹”(PCR clampingPNA在核酸捕获和基因分离中的应用PNA应用于生物传感器PNA与质谱技术的联用,PNA在疾病诊疗中的应用,PNA与疾病诊断基因探针及由其组成的基因芯片已被应用于临床。相应的PNA探针能够消除静电的排斥力，较易进入DNA分子，构建比较方便，且特异性、亲和性比传统的基因探针和基因芯片更强，因而诊断疾病的效果更佳.PNA在疾病治疗中的应用:PNA可作为反义、反基因药物。关于PNA的分布研究表明，除脑以外，PNA能快速输送到所有组织，其血清半衰期为610 min，静脉半衰期大约为10 min，从而实现了PNA对疾病的治疗作用,DNA的三级结构与功能,DNA超螺旋染色质和核小体,DNA超螺旋,双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。超螺旋分为正超螺旋和负超螺旋两种。真核生物中，DNA与组蛋白八聚体形成核小体时存在着负超螺旋。所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产生的。自从1965年Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的超螺旋以来，现知道绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalently closed circle,CCC)分子，这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)，真核染色体为线形分子,但其DNA均与蛋白质相结合，两个结合点之间突环(loop)结构类似于CCC分子，同样具有超螺旋形式。,DNA超螺旋,超螺旋结构,DNA三级结构,核小体,染 色 质,染色质,DNA变性,融解温度(Tm,melting temperature)。Tm=69.30.41(G+C)%,DNA复性,热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火(annealing)。一般认为比Tm低25左右的温度是复性的最佳条件。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持DNA的单链状态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。DNA浓度 DNA顺序的复杂性,RNA的种类、分布、功能,RNA一级结构,信使RNA的结构与功能,内含子(intron),*mRNA成熟过程,外显子(exon),*mRNA结构特点,1.大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。,2.大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。,帽子结构,mRNA核内向胞质的转位mRNA的稳定性维系翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,真核细胞mRNA的3-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为“尾结构”，5-末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为“帽结构”。,mRNA一级结构的特点,RNA的二级结构,tRNA的二级结构都呈“三叶草”形状，在结构上具有某些共同之处，一般可将其分为五臂四环：包括氨基酸接受区、反密码区、二氢尿嘧啶区、TC区和可变区。除了氨基酸接受区外，其余每个区均含有一个突环和一个臂。,核蛋白体,核蛋白体的组成,*rRNA的种类（根据沉降系数）,真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA,原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNA,5S rRNA,tRNA的三级结构,snmRNAs的种类核内小RNA核仁小RNA胞质小RNA催化性小RNA小片段干涉 RNA,snmRNAs的功能参与hnRNA和rRNA的加工和转运。,1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0,OD260的应用,DNA变性,复性,分子杂交(hybridization),限制性内切酶（restriction enzyme）,基因组与基因组学概念,基因组(genome):泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质；在真核生物，基因组是指一套染色体（单倍体）DNA,如人基因组指24条（22+X,Y）染色体上的遗传信息。基因组学(genomics):发展和应用DNA制图、测序新技术以及计算机程序，分析生命体全部基因组结构及功能。,基因组学Genomics,基因组学包括3个不同的亚领域：结构基因组学(structural genomics)功能基因组学(functional genomics)比较基因组学(comparative genomics),结构基因组学(structural genomics),结构基因组学:就是制作高分辨率的人类遗传图和物理图，最终完成生物全部基因组DNA序列测定.结构基因组学通过HGP的实施来完成的。HGP就是制作高分辨率的人类遗传图和物理图，最终完成人类全部基因组DNA序列测定，因此HGP属于结构基因组学范畴。,HGP包括以下研究内容,物理制图 遗传制图 基因组DNA序列测定 创建计算机分析管理系统通过HGP获得的广泛基因组信息组成了结构基因组学的基本内容;是开展功能基因组学的研究的基础；为研究单基因遗传病,多基因遗传病研究的基础提供“平台”。,功能基因组学（functional genomics）,完成一个生物体全部基因组测序后即进入后基因组测序阶段详尽分析序列，描述基因组所有基因的功能，包括研究基因的表达及其调控模式，这就是功能基因组学。,功能基因组学,主要具体内容包括以下方面:鉴定DNA序列中的基因 同源搜索设计基因功能 实验性设计基因功能 描述基因表达模式,比较基因组学,比较基因组学(comparative genomics)涉及比较不同物种的整个基因组，以便深入理解每个基因组的功能和进化关系。,基因组学与医学关系,基因病的概念疾病相关基因的鉴定基因组学与肿瘤病因学基因组学与流行病病因学基因组学环境与疾病基因组学与药物分析和设计,基因病的概念,以基因组学为基础，从疾病和健康的角度考虑，人类疾病大多直接或间接地与基因相关，故有“基因病”概念产生。根据这一概念，人类疾病大致分为三类：单基因病 多基因病 获得性基因病,疾病相关基因的鉴定,检测基因变异或突变 疾病时基因组差异表达分析 染色体制图定位及疾病相关基因克隆,检测基因变异或突变,寡核苷酸杂交分析-SNP 等位基因特异寡核苷酸杂交 DNA芯片检测的差异表达谱,基因诊断与基因治疗,(gene diagnosis and gene therapy),基因变异致病类型,内源基因的变异:基因结构异常 基因表达异常,外源基因的入侵,1.定义:利用现代分子生物学和分子遗 传学的技术和方法，直接监测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。,2.特点:针对性强 特异性高 灵敏度高 适应性强,DNA 诊断常用技术方法,核酸分子杂交技术 限制性内切酶酶谱分析法DNA限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析 等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide,ASO)聚合酶链反应(PCR)基因测序基因芯片,限制性内切酶酶谱分析法:限制性内切酶 特异性DNA探针,Mst酶切位点(GCTNAGG),0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,DNA限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析 DNA限制性片段长度多态性(RFLP):DNA发生突变时，可能使突变所在部位的序列获得或失去某种限制性内切酶识别位点，或当DNA分子内部发生较大的顺序突变如缺失、重复、插入以及DNA高变区内某些重复顺序的拷贝数改变时则会引起其限制性内切酶位点发生相对移动，酶解该基因组时所产生的的限制性片段的数目和每个片段的长度不同，称为DNA限制性片段长度多态性(RFLP)。,RFLP分析法,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,PCR 基本工作原理,PCR/单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism,SSCP)PCR后将产物变性，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因因碱基序列不同，形成不同的空间构象，在电泳时泳动速度不同，借此分析基因是否存在突变的分析方法。,RNA诊断技术(以mRNA为检测对象)RNA点杂交 Northern分析定量 逆转录PCR mRNA差异显示PCR技术,基因诊断的应用,遗传疾病肿瘤感染性疾病，传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定,基因治疗,1.定义：早期 是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。,目前 广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。,方法：基因矫正(gene correction)基因置换(gene replacement)基因增补(gene augmentation)基因失活(gene inactivation),基因矫正(gene correction):将致病基因的异常碱基进行纠正，而正常部分予以保留。基因置换(gene replacement)将正常基因通过体内基因同源重组，原位替换细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。最为理想的治疗方法。,基因增补(gene augmentation)将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，通过目的基因的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有功能加强。目前基因治疗多采用此方法。,基因失活(gene inactivation)采用反义核酸肽核酸等技术，在转录和翻译水平上阻断某些基因的 异常表达，以达到治疗的目的。,几种常见的基因失活技术,反义核酸技术：能与mRNA互补结合的单链RNA三链技术:能与双链DNA形成三链DNA的单链DNA干扰RNA技术:一种双链RNA核酶技术,基因治疗的其他方法：“自杀基因”的应用，基因疫苗等,自杀基因 某些细菌或病毒产生的酶能将对人体无毒或低毒的药物前体，在人体细胞内一系列酶的催化下转变成细胞毒性物，从而导致细胞死亡，编码这种细菌或病毒的酶的基因称为自杀基因。,DNA疫苗：一种将编码外源性抗原的基因插入含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中持续表达抗原蛋白，诱导机体产生持续免疫应答的一种疫苗，又称为第三代疫苗。,基因治疗的基本程序：,治疗性基因的选择,基因载体的选择 病毒载体 非病毒载体,靶细胞的选择 体细胞 生殖细胞,基因转移 间接体内疗法(ex vivo)直接体内疗法(in vivo),外源基因表达的筛选 较多利用Neor标记基因,回输体内,4.基因治疗的应用与展望,应用：遗传性疾病 心血管疾病 肿瘤 感染性疾病 神经系统疾病,展望：进一步寻找切实有效的基因 精密调控外源基因在人体内的表达 体细胞移植和重建的生物学研究 减少外源基因对机体的不利影响,针对核酸序列的预测方法,重复序列分析 编码区特性分析启动子分析内含子/外显子剪接位点翻译起始位点翻译终止信号 tRNA基因识别,核酸序列的预测,核酸序列的预测是在核酸序列中寻找基因，基因的位置和功能位点的位置，以及标记已知的序列模式等过程。确定基因的位置和结构需要多个方法综合运用，规则：对于真核生物序列，在进行预测之前先要进行重复序列分析，把重复序列标记出来并除去；选用预测程序时要注意程序的物种特异性；要弄清程序适用的是基因组序列还是cDNA序列；很多程序对序列长度也有要求，有的程序只适用于长序列，而对EST这类残缺的序列则不适用。确认一段DNA序列是一个基因需要有多个证据的支持。一般而言，重复片段频繁出现的区域不太可能出现基因编码区和调控区；某段DNA片段的假想产物与某个已知的蛋白质或其它基因的产物具有较高序列相似性，这个片段就非常可能属于外显子片段；在一段DNA序列上出现统计上的规律性，即“密码子偏好性”，与“模板”序列的模式相匹配、如TATA Box等相匹配等,这段DNA是蛋白质编码区.,RNA的结构预测,为了进行RNA的结构预测，首先要充分研究已有的一些RNA分子晶体及合成的溶液中的一些RNA分子片断的结构特点，并从中归纳结构规则。RNA的二级结构预测已有20多年的历史，主要有两种：早期的是种系比较方法，即对于在不同有机体中起相同生物功能的RNA的一级结构进行比较（同源序列一般不少于8种）.此法的困难在于：一是许多RNA分子的同源序列不易得到；二是需要大量人力，预测效率较低。目前主要采用的是热力学方法，种系比较法作为辅助方法。热力学方法是基于寻找RNA序列所能采取的各种构象中具有最小自由能的结构，再加上巧妙的计算机算法使之具有速度快、准确率