《核酸的化学》PPT课件.ppt

第二章,核酸的化学,主要内容,核酸的组成成分 核酸的一级结构 DNA的二级结构DNA的高级结构DNA和基因组RNA的结构和功能核酸的性质核酸的序列测定,本章重点及难点重点：掌握核酸构件分子的结构特点、代号；掌握DNA二级结构特点、稳定力、三级结构特点及有关概念；掌握RNA二级结构特点、类型；了解核酸的重要理化性质。难点：构件分子的结构特点，DNA二级结构要点及三级结构有关概念，tRNA二级结构特点、真核生物mRNA二级结构特点，核酸理化性质中涉及的概念及应用。,核 酸(nucleic acid),是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。,一、核酸的发现和研究工作进展,1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素”1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构1968年 Nirenberg发现遗传密码1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法1985年 Mullis发明PCR 技术(Polymerase chain reaction)-聚合酶链式反应 1990年 美国启动人类基因组计划(HGP)1994年 中国人类基因组计划启动2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架,二、如何证明核酸是遗传物质的载体？,1944年的细菌转化实验是获得DNA携带遗传信息的第一个证明；1952年Alfred D.和Hershey等人建立的T2噬菌体捣碎的实验，这是第二个证据，证明噬菌体复制的物质是DNA而不是蛋白质外壳；1953年 Watson和Crick的DNA双螺旋模型的发现，更进一步揭示了DNA作为遗传物质储存和信息传递的化学机制；核酶的发现，一些核酸本身具有酶催化的活性。,Avery的转换转化实验用肺炎病菌,肺炎病菌有二种:一种是光滑型肺炎双球菌（S）：有荚膜、菌落光滑且有毒。这种菌通常外包有一层黏性发光的多糖荚膜，它是细菌致病性的必要成分，引起肺炎；另一种是粗糙型肺炎双球菌（R）：无荚膜、菌落粗糙且无毒。,1944年，Avery的转换转化实验,or,and,可分离,转化实验第一步,（a）将光滑型肺炎双球菌注入小鼠体内，使小鼠致死。,转化实验第二步,（b）将粗糙型肺炎双球菌注入小鼠体内，对小鼠无害。,转化实验第三步,（c）将光滑型肺炎双球菌加热杀死后，再注入小鼠体内，对小鼠无害。,转化实验第四步,（d）将加热杀死的光滑型肺炎双球菌与粗糙型肺炎双球菌一起注入小鼠体内，小鼠死掉。这说明粗糙型肺炎双球菌变成了致死的光滑型肺炎双球菌。暗示着被杀死的光滑型肺炎双球菌中含有某种因子，它进入了粗糙型肺炎双球菌将它转化成了致死的光滑型肺炎双球菌。,转化实验第五步,（e）从加热杀死的光滑型肺炎双球菌中提取DNA，并且尽可能地将混在DNA中的蛋白质除去，然后将除去了蛋白质的DNA与粗糙型肺炎双球菌混合后，再注入小鼠体内，小鼠死掉。,结论：,Avery实验说明带有有毒性的和能使荚膜形成的信息分子DNA整合进了无毒菌种的染色体里，使它转化成了有毒的菌种。从一个供体菌得到DNA，通过一定的途径，授予另一个细菌，从而使后者的遗传特性发生改变的作用，称之转化作用。1944年，等人发表了脱氧核糖型的核酸是III型肺炎球菌转化要素的基本单位即DNA是细菌的转化因子，第一次证明了DNA是遗传物质。,第一节,核酸的组成成分,核酸的基本化学组成,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,碱基,戊糖,核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定。,核酸的基本化学组成,1,2.元素组成：C H O N P,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。核苷中的D-核糖与D-2-脱氧核糖均为呋喃型环状结构。糖环中C1是不对称碳原子，所以有-及-两种构型。（-OH在上为-，-OH在下为-）但核酸分子中的糖苷键均为-糖苷键。（为区别碱基环中的标号，糖环中的碳原子标号用1，2，表示）：戊糖有2、3、5位自由-OH，因此可以形成2、3、5-核苷酸，其中5-核苷酸为默认的核苷酸。,一、戊糖（核糖和脱氧核糖）,两种戊糖结构,嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine,A),鸟嘌呤(guanine,G),二、碱基,注：嘌呤环和嘧啶环上各原子的标号是目前国际上普遍采用的统一编号。,嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine,C),尿嘧啶(uracil,U),胸腺嘧啶(thymine,T),二、碱基,碱基的互变异构,酮式烯醇 C=O C-OH N N氨基亚氨基 C-NH2 C=NH2+HN HN 受介质pH影响,三、核苷,核苷 戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键。核苷的碱基与糖环平面互相垂直。糖环上的C1与嘧啶碱的N1和嘌呤碱的N9相连接。,核苷：A,G,U,C脱氧核苷：dA,dG,dT,dC,核苷的表示法,假尿苷（）见P66次黄苷（肌苷）I黄嘌呤核苷 X二氢尿嘧啶核苷 D,Adenosine Guanosine Cytidine Uridine,核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP,四、核苷酸的结构,核苷酸（nucleotide）,A U C G,UDP,CTP,举例：AMP,A T C G,dADP,dTTP,dGMP,核苷酸的命名及其符号,（脱氧）苷 磷酸,两类核酸在分子组成上的异同点,RNA,DNA,组 分,磷 酸,磷 酸,戊 糖,核 糖,脱氧核糖,碱基,嘌 呤,嘧 啶,A G,U,C,T,补充：1.碱基修饰,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,ATP(腺嘌呤核糖核苷三磷酸),各种核苷三磷酸化合物（可简写为ATP，CTP，GTP，UTP）实际是体内RNA合成的直接原料。各种脱氧核苷三磷酸化合物（可简写为dATP，dCTP，dGTP和dTTP）是DNA合成的直接原料。它们在连接起来构成核酸大分子的过程中脱去“多余”的二分子磷酸。有些核苷三磷酸还参与特殊的代谢过程，如UTP参加磷酯的合成，GTP参加蛋白质和嘌呤的合成等。,2.核苷酸的重要衍生物,细胞信息传递的重要信使。cAMP在体内由ATP转化而来，是与激素作用密切相关的代谢调节物。,3.cAMP 和 cGMP,4.其它体内核苷酸衍生物,在生物体内还有一些参与代谢作用的重要核苷酸衍生物，如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶，NAD）、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（辅酶，NADP）、黄素单核苷酸（FMN）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）等与生物氧化作用的关系很密切，是重要的辅酶。,核苷酸的功能,1、细胞中的携能（carry chemical energy）核苷酸 核苷酸共价连接于核糖-5，-羟基上的磷酸可有一个、二个或三个。分别称为：核苷单磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸。而重要的是腺苷的磷酸酯。见P44-图2-4。2、核苷酸是许多酶的辅因子的结构成分 如：辅酶和辅酶及FAD等。见P44下。3、一些核苷酸是细胞通讯的媒介 细胞对环境事件作出反应是由围绕它的激素和信号化合物提示的。这些细胞外化学信号（第一信使）和细胞受体的互相作用常常导致细胞内“第二信使”（second messengers）的产生，由它们导致细胞内部的适应性改变。第二信使常常是一种核苷酸。如：cAMP及核苷多磷酸等。见P45。,第二节,核酸的一级结构,核酸的一级结构,定义核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。,核苷酸的连接方式,核苷酸之间以磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。DNA和RNA中的核苷酸残基都是通过磷酸基团这个“桥”而共价连接的。即核酸的主链是由相间出现的磷酸核糖残基通过共价键连接起来的，各种碱基可以看成是联系在主链上的侧链基团。见P71图3-13,5磷酸,3羟基,3,5-磷酸二酯键,多聚核苷酸（核酸）,多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3-OH 与另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,核 酸,磷酸+戊糖+含氮碱核苷酸核酸,核酸的表示方式,1、短线式表示法,5pTpApCpGpApGpCpTpTp3,5-T-A-C-G-A-G-C-T-T-3,2、字母表示式,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,5-磷酸端（常用5-P表示），3-羟基端（常用3-OH表示）；多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35；戊糖用垂直竖线表示，五个C从上到下依次为15。,多核苷酸链,第三节,DNA的二级结构,DNA的二级结构,Watson和Crick发现双螺旋结构-DNA二级结构是科学史上的重大事件。它导致一些全新学科的诞生并影响许多学科的发展进程。,DNA的二级结构-双螺旋结构DNA双螺旋结构的研究背景和历史意义DNA双螺旋结构模型要点,一、DNA的二级结构-DNA的双螺旋模型,DNA的二级结构双螺旋结构,（一）双螺旋结构模型的实验依据,1、对DNA分子结晶的X衍射数据：由Franklin和Wilkins提供，来源不同的DNA的二级结构非常相似。前者早逝，后者与Watson、Creck分享了诺贝尔奖。,DNA X射线衍射图,（一）双螺旋结构模型的实验依据,（一）双螺旋结构模型的实验依据,3、大量的电位滴定和其它物化数据 核苷酸之间以磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。,（二）DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）,DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。螺旋直径为2nm，形成大沟(major groove)及小沟(minor groove)相间。,（二）DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）,碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T;GC）。相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。,碱基互补配对,T,A,G,C,（二）DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）,氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。,碱基堆积力(包括纵向的疏水作用力和碱基间电子的相互作用)（主要）,B型结构 两条链反向平行，右手螺旋 碱基在内（AT，GC）碱基平面垂直于螺旋轴 戊糖在外，双螺旋每转一周 为10个碱基对（bp）A型结构 碱基平面倾斜20，螺旋变粗变短，螺距23nm。Z型结构 左手螺旋，只有小沟,（三）DNA双螺旋结构的构象类型,双螺旋DNA的结构参数,双螺旋稳定的力 氢键 碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力）离子键等,ts-DNA：三股螺旋（在分子内或分子间形成，分子内形成时需要低 pH下胞嘧啶质子化，故称H-DNA）。,Hoogsteen配对：Py Pu*Py；Py Pu*Pu 和 Py Pu*rPy,H-DNA存在于基因调控区和其他重要区域，故显示出具有重要的生物学意义。,DNA的双螺旋结构的意义,该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的提出是20世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。,B型双螺旋DNA的结构特点：,1.为右手反平行双螺旋；2.主链位于螺旋外侧，碱基位于内侧；3.两条链间存在碱基互补：A与T或G与C配对形成氢键，称为碱基互补原则（A与T为两个氢键，G与C为三个氢键）；4.螺旋的稳定因素为氢键和碱基堆积力；5.螺旋的螺距为3.4nm，直径为2nm。DNA双螺旋的稳定因素：碱基之间的氢键是主要因素，而碱基堆积形成的疏水作用（碱基堆积力）是更重要的因素。由于碱基是杂环，当相互距离较接近时，其电子云相互交盖而形成碱基堆积力。,第四节,DNA的高级结构,什么是超螺旋(superhelix 或supercoil)？DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,一、环状DNA的超螺旋结构,向左捻,向右捻,松弛型,正超螺旋,负超螺旋,意义DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。,环状DNA状态的转变,二、原核生物DNA的高级结构,三、DNA在真核生物细胞核内的组装,真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是 核小体(nucleosome)。,核小体的组成：其结构为一个组蛋白聚合体（H2A、H2B、H3、H4各2分子），DNA链在其外侧绕1.75圈，H1组蛋白位于外侧。DNA：约200bp(其中146bp 的核心DNA围绕组蛋白形成左手超螺旋,54bpDNA用于连接)组蛋白：H1H2A，H2BH3H4,H2A、H2B、H3和H4形成八聚体,组蛋白和DNA形成核小体,染色体的结构组装过程,核小体（nucleosome）由146bp DNA围绕8个组蛋白分子（H2A，H2B，H3，H4个2个），绕1圈，H1结合在连接区，每个核小体大致包含200bp DNA。,总结：,核小体nucleosome（真核生物）DNA+组蛋白（H1、H2A、H2B、H3、H4）,DNA链形成的核小体串,染色体DNA的组装层次,从DNA到染色质,从DNA到染色质丝，DNA压缩了近100倍，若从DNA到最后凝缩成染色体，DNA压缩了近万倍。,第五节,DNA和基因组,DNA的功能,DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。,基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。,一、基因和基因组的概念,基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物细胞中DNA 分子的最小功能单位（交换单位）。基因组（genome）：某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物质的总和，包括：核基因组（拟核/核DNA）及核外（质粒/质体DNA）。,二、病毒和细菌基因组的特点,(一)病毒和细菌基因组的特点：1.基因组较小2.基因组大部分序列是用来编码蛋白质的。基因间间隔序列短。3.功能相关的基因常串联在一起，并转录在同一mRNA分子上，有基因重叠现象。,（二）病毒基因组核酸的主要类型,正股(+)：序列与mRNA相同的链 负股(-)：序列与mRNA互补的链,（三）病毒基因组的特点,1病毒基因组只含有一种核酸,2核酸结构多样性：,DNA 或RNA 单链或双链 合环状分子或线性分子,3.有重叠基因,(四)细菌基因组结构的特点：,1、基因组为环状双链DNA分子2、编码蛋白质的基因为单拷贝的,但rRNA 基因一般为多拷贝。3、分子中有多功能识别区域4、存在可移动DNA序列,复制、转录起始区 复制、转录终止区,质粒（plasmid）是细菌内携带的染色体以外的DNA分子，是共价闭合环状DNA（covalent closed circular DNA，cccDNA）1、最大特点:可独立复制2、质粒的遗传控制,三、真核生物基因组特点,真核生物除了核染色体以外，还存在细胞器DNA，如线粒体和叶绿体的DNA，为双链环状，可自主复制。有的真核细胞中也存在质粒，如酵母和植物。真核生物基因组指一个物种的单倍体染色体组(1n)所含有的一整套基因。还包括叶绿体、线粒体的基因组。,真核细胞基因结构：,真核生物的结构基因是断裂的基因。一个断裂基因能够含有若干段编码序列，这些可以编码的序列称为外显子。在两个外显子之间被一段不编码的间隔序列隔开，这些间隔序列称为内含子。,1.真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因的基因组是双份的（即双倍体,diploid），即有两份同源的基因组。2.真核细胞基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链。3.存在重复序列，重复次数可达百万次以上。4.基因组中不编码的区域多于编码区域。5.大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的。6.基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点，而每个复制子的长度较小。,真核生物基因组特点,真核基因组与原核基因组的比较,1.真核基因组的长度比原核的大 2.真核基因组中有内含子经过翻译后被剪切而原核中没有内含子 3.真核基因表达调空正性调节为主，原核生物负调节为主 4.有的原核基因组可以整合到真核基因中例如逆转录病毒基因,第六节,RNA的结构与功能,碱基组成 A、G、C、U（AU/GC）稀有碱基较多，稳定性较差，易水解多为单链结构，少数局部形成螺旋分子较小分类mRNA（hnRNA 核不均一RNA）tRNA rRNA snRNA/asRNA少数RNA病毒,一、结构共性,RNA的种类、分布、功能,*tRNA(7090个核苷酸组成，沉降系数为4S左右)的一级结构特点 含 10-20%稀有碱基 3末端为 CCA-OH 5末端大多数为G 具有 TC序列,二、转运RNA的结构与功能,tRNA：15%，70-90个核苷酸 特点（稀有碱基多，分子量小）结构：二级结构-三叶草形主要组成:四臂三环,氨基酸臂功能：结合氨基酸,TC环,额外环（可变环）,反密码子功能：识别密码子,*tRNA的三级结构 倒L形,*tRNA的功能活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,占RNA总量的80,三、rRNA的结构与功能,功能:参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。,特征：单链，螺旋化程度较tRNA低 与蛋白质组成核糖体后方能 发挥其功能,真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA,原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNA,核蛋白体的组成,mRNA特点：含量最少（3-5%），种类多 寿命短 代谢最快 结构：原核细胞mRNA整个分子分为三部分，即5非编码序列、编码序列、3非编码序列,四、mRNA和hnRNA,真核细胞mRNA分子分为五部分帽子、5非编码序列（前导序列）、编码序列、3非编码序列（拖尾序列）和尾巴,mRNA核内向胞质的转位mRNA的稳定性维系翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,*mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,内含子(intron),*mRNA成熟过程:,外显子(exon),hnRNA（核不均一RNA):即mRNA的初级产物。,五、snRNA和asRNA,snRNA主要存在于细胞核中 存在形式：核糖核酸蛋白 作用：1.分子中含U多的在hnRNA和rRNA的加工中起重要作用2.其他snRNA在控制细胞的分裂和分化,协助细胞内物质运输,构成染色质等方面起重要作用 asRNA的作用:主要在翻译水平抑制基因表达还可抑制DNA的复制和转录,核酶riboeyme具有催化作用的RNA。进一步深化了人们过去对酶的本质的认识；在肿瘤和病毒性疾病的治疗中起作用。RNA在DNA的复制、转录、翻译中均有一定的调控作用，与细胞内或细胞间一些物质的运输和定位有关。,RNA的其他功能,核酸和蛋白质的比较,第七节,核酸的性质,一、一般的理化性质,核酸的两性性质及等电点与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为44.5，RNA的等电点为22.5。RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种作用。,二、核酸的紫外吸收特性,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。,吸收,光吸收基团:碱基原因:碱基有共轭大键,用途：定性检测核酸,三、核酸的变性(denaturation),定义：在某些理化因素作用下，稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，DNA双链解开成两条单链的过程。核酸的一级结构(碱基顺序)保持不变。,因素：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：,OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失,DNA的变性过程,加热,部分双螺旋解开 无规则线团 链内碱基配对,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫外吸收光谱,增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,热变性,解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。,S型曲线下方平坦段,表示DNA的氢键未被破坏,待加热到某一温度处时,次级键突发断开,DNA迅速解链,同时伴随吸光率急剧上升,此后因“无链可解”而出现温度效应丧失的上方平坦段。,DNA的熔解温度Tm,定义 增色效应达到一半时的温度或DNA双螺旋结构失去一半时的温度。影响Tm的因素 DNA的均一性 G、C的含量 介质中的离子强度 DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,（因热变性是在很狭的温度范围内突发的跃变过程,很像结晶达到熔点时的熔化现象,故名熔解温度。）,四、核酸的复性,变性核酸的互补链在适当的条件下，重新通过碱基配对缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性，这一过程叫淬火。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。退火温度Tm25复性影响因素 片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。*核酸杂交的分子基础是？,五、核酸分子杂交(hybridization),概念：不同来源的核酸链因存在互补序列而形成互补双链结构，这一过程就是核酸杂交过程。包括 DNADNA 杂交 DNARNA 杂交 RNARNA 杂交原因：不同核酸的碱基之间可以形成碱基配对用途：是分子生物学研究与基因工程操作的常用技术,核酸杂交,加 温,缓慢降温,（变 性）,（复 性）,（分 子 杂 交）,杂交技术,Southern 杂交（Southern bolting）用于检测DNANorthern 杂交（Northern bolting）用于检测RNAWestern 杂交（Western bolting）用于检测蛋白质,Southern 杂交,由英国的分子生物学家E.M.Southern所发明的，是一种从琼脂糖凝胶上把变性的DNA转移到硝酸纤维素膜上的技术，在膜上的DNA可与DNA探针杂交而检出DNA的量，也叫DNA印迹技术用于钓基因，即用已知的DNA单链或RNA，钓取未知DNA分子中的基因,Southern 杂交,方法如下：未知的DNA-DNA限制性内切酶 DNA片段-琼脂糖电泳分离-碱液变性-影印在硝酸纤维薄膜上-与放射性标记的已知DNA单链或RNA杂交-放射自显影,Northern Blotting（北印迹）,Northern Blotting（北印迹）：用已知的DNA钓mRNA，方法如下：众多未知的RNA-电泳分离-变性-影印-用标记的已知DNA单链杂交-放射自显影,Western Blotting（西印迹）,Western Blotting（西印迹）：蛋白质与抗体的杂交，跟核酸无关。,研究DNA分子中某一种基因的位置定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础,核酸分子杂交的应用,核酸分子杂交的意义：,发现原核生物的基因是连续基因，而真核生物的基因是断裂基因。连续基因：基因中的bp序列能够连续的在成熟的蛋白质中找到其相应的AA，电镜显示这种基因能够和它的成熟mRNA形成平滑的杂交分子。断裂基因：基因中的bp序列能够断续的在成熟的蛋白质中找到其相应的AA，电镜显示这种基因和它的成熟mRNA只能形成带泡的杂交分子。见讲义草图P78发现癌基因的普遍性：肿瘤病毒的RNA能够与人类正常的DNA分子形成带泡的杂交分子。,第八节,核酸的序列分析,核酸的序列测定,遗传信息储存在DNA分子一级结构的核苷酸序列中，特定的序列表达的信息是什么？首要的任务是序列测定。人类基因组基本框架已经建立，并期望尽快弄清全部基因组序列，以便掌握人类生、老、病、死的奥秘。因此，DNA序列分析技术与方法，当之无愧成为揭开生命之秘的一把金钥匙。,Sanger法,1Sanger双脱氧末端终止法基本原理 剑桥大学著名生物化学家F.Sanger于1977年发明的一种简单快速DNA序列测定新方法，该方法要求的基本条件是：选取高纯度的待测单链DNA作模板；供给5标记的短链DNA引物和dNTP底物；具有热稳定性好、活性高的DNA聚合酶 如Kelenow片段或Taq酶等）；尤其需要加入可随机终止链式聚合反应的试剂2，3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。,F.SangerDNA序列测定方法的要点是,把待测DNA样品分出四份，分别置于编号试管加入底物dNTP、聚合酶、5被放射性标记的DNA引物；给各试管分别加入一种ddNTP；保温反应后，从各管分别取样，并在同一块凝胶上进行PAGE分离、放射性自显影；根据显带拼读碱基序列。,试管反应液中如果加入ddNTP的是ddATP（如图2-33中的第1号试管），聚合酶在链式聚合反应过程中的某一次反应，会在标记的引物新生链3-OH上，根据模板（T）的要求掺入ddAMP。一旦掺入ddAMP后，由于其3-端无游离的-OH，因此该标记的新生链的延伸即告终止。因为反应掺入ddAMP是随机的，结果会在反应液中存在以ddAMP为结尾的各种长度的新生DNA片段。其它试管则类似存在以ddCMP、ddGMP、ddTMP结尾的各种长度的片段。四种反应液分别作样品，在同一胶面上进行PAGE电泳分离。由于PAGE方法有很高的分辩率，即使相差一个单核苷酸的标记片段也能使之分开。最后通过放射性自显影术显带后，便可以读出待测DNA核苷酸顺序。通过F.Sanger法，有经验的工作者可以测定含有200300核苷酸的DNA顺序。有关测定原理见图2-33。,双脱氧法的特点是需要单链模板、寡核苷酸引物和高质量的DNA聚合酶。该方法的优点是简单、快速。缺点是聚合反应会因为二级结构而提前终止，常常测不到准确的DNA序列；由于需要经模板与引物结合后，才能反应并测序，因此对于寡聚核苷酸DNA序列，例如对引物DNA的序列不能测定。该法直接分析的是合成的新链序列，而不是模板链，因此不能分析模板中甲基化部位；需要适当的引物和能合成单链模板的载体。,核酸的序列测定,双脱氧链终止法（Sanger酶法）2.Gilbert化学降解法,课堂练习答案,相同:虽然二者在组成上差异很大,但在构成方式上却很相似,主要表现在都是由基本结构单位通过特定的共价键连接而成的大分子，各自的主链都是不变成分，可变成分在侧链上。,1、试比较核酸、蛋白质一级结构的异同，写出各自基本结构单位的通式,2、简述研究核酸、蛋白质一级结构的意义。,生物的遗传信息储存于DNA的核苷酸序列中，蛋白质的一级结构是由相应的DNA序列决定的，每一种蛋白质分子所具有的特定的一级结构又决定了其高级结构和生物学功能，也就表现出特定的生命现象。因此，研究核酸、蛋白质的一级结构可破译生命的密码，是在分子水平认识生命的突破口。,本 章 小 结,核酸是遗传物质载体的证明和研究历史核酸的化学结构：戊糖、碱基（A、T、G、C、U），核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号）DNA的结构：一级结构（核酸序列及其表示、基因及基因组、序列测定）、二级结构（Watson Crick双螺旋模型、ZDNA）、结构维持的化学键RNA结构与功能：碱基组成特点、RNA的种类结构及功能核酸的性质：酸碱性、变性与复性、分子杂交,