《核酸的制备》PPT课件.ppt
,核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段。优点：（1）便于分离;（2）便于检测;（3）便于回收。,第四节 核酸样品的分析与检测,一、核酸样品的凝胶电泳分析(一)凝胶电泳检测核酸的基本原理 核酸分子在中性或偏碱性的缓冲系统中带负电，在电泳过程中，核酸分子从负极向正极移动，并按核酸构型和分子大小分离开。电泳后用染料染色。由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数。因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳,（二）琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合线性分子，一般含有多糖、蛋白质和盐等杂质，杂质的含量每个厂商和批号的产品不尽相同。对DNA电泳迁移率的影响也不一样，经化学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂糖，其机械强度无明显变化，主要用于DNA的限制酶原位消化、DNA片段回收以及小DNA片段（10500 bp）的分离。琼脂糖凝胶的孔径取决于琼脂糖的浓度。,琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。,(1)凝胶缓冲液和电泳缓冲液 TBE,TAE TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；TBE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量。双链线状DNA片段在TAE中比在TBE中迁移快10%。对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。,不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围,(3)加DNA样品 载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；2）使样品带有颜色便于简化上样过程；3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。,(4)凝胶电泳的标准DNA(5)电泳条件(6)溴化乙锭染色和紫外观察 通过染色,紫外灯下检测。主要有溴化乙锭（ethidium bromide,EB）染色法和SYBR Gold染色法。,EB被认为是一种强致癌物质EB可用来检测单链或双链核酸,当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。,2000 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp,SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。,可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。,（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳,在TEMED(四甲基乙二胺)催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。在双功能交联剂如N，N-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。,CH2=CH-C(O)-NH2(丙烯酰胺）CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2（N，N-亚甲双丙烯酰胺）,1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。,2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。用途：制备高纯度的DNA片段。,DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围,注:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30;,（四）脉冲场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresis PFGE,为何选PFGE？超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。但 PEGE 解决了这一问题。,PFGE 工作的基本原理 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。,脉冲电场电泳示意图,垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field)场翻转系统(field inversion)旋转胶系统(rotating gel)钳位均匀电场系统(contour-clamped homogeneous electric field),（五）变性凝胶电泳,RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%-1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所抽提的总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。,总RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,RNA电泳图,DNA变性凝胶电泳主要用于检测DNA分子中的碱基组成的变异。电泳过程中当双链DNA分子处于变性条件时，解离成单链，在有变性剂的凝胶中泳动速度发生变化，最终停下在特定的位置，碱基组成不同则停在不同的位置。,该方法是将PCR扩增的产物量一中性聚丙烯酰胺凝胶上，在一温度线性梯度上升的电场中进行电泳，当DNA双链到达其Tm时，双链解开，形成分叉，而影响电泳迁移率，突变的扩增产物其Tm值与野生型有明显不同，因而有不同的解链区，从而造成电 泳迁移效率的差别，据此可判断样品中DNA有无突变。,
