《核酸化学》PPT课件.ppt

第四章核酸化学,核酸的概述,1869年瑞士外科医生Miescher从细胞核中分离出核素。,1889年Altman制备了核酸制品，命名为核酸。,193040年，Kossel 和 Levene等确定核酸的组分后，明确核酸的类别：,1944年，Avery 的“肺炎双球菌转化”实验证明DNA是有机体的遗传物质：,or,and,可分离,除少数病毒（RNA病毒）以RNA作为遗传物质外，多数有 机体的遗传物质是DNA。,不同有机体遗传物质（信息分子）的结构差别，使得其所 含蛋白质（表现分子）的种类和数量有所差别，有机体表 现出不同的形态结构和代谢类型。,RNA的主要作用是从DNA转录遗传信息，并指导蛋白质的 合成。,1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型。,核酸与蛋白质一样，是一切生物有机体不可缺少的组成部分。核酸是生命遗传信息的携带者和传递者，它不仅对于生命的延续，生物物种遗传特性的保持，生长发育，细胞分化等起着重要的作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传病、代谢病等也密切相关。因此，核酸的研究是现代生物化学、分子生物学和医学的重要基础之一。,98核中（染色体）真核 线粒体（mtDNA）核外 质粒（plasmid）叶绿体（ctDNA）DNA 拟核 原核 核外：质粒（plasmid）病毒：DNA病毒,核酸的种类和分布,核酸分为两大类：脱氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid（DNA）核糖核酸 Ribonucleic Acid（RNA）,mRNA(5%)真核 tRNA(10-15%)rRNA（80%）SnRNA(核内）sRNA SnoRNA(核仁）RNA mRNA ScRNA(胞内)原核 tRNA rRNA 病毒：RNA病毒,第一节 核酸的组成成分,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,碱基,戊糖,元素组成：C H O N P(9%-9.9%),嘌呤,嘧啶,核糖,脱氧核糖,核酸水解,一、糖组分(戊糖),-D-核糖（存在于RNA中）,-D-2-脱氧核糖（存在于DNA中）,核糖+H+,糠醛,甲基间苯二酚,FeCl3,绿色产物,脱氧核糖+H+,-羟基-酮戊醛,二苯胺,蓝色产物,RNA和DNA定性、定量测定,嘧啶,胞嘧啶 Cytosine,（Cyt）,尿嘧啶 uracil,（Ura）,胸腺嘧啶 thymine,（Thy）,（一）嘧啶碱是嘧啶的衍生物,CH3,二、碱基嘌呤碱和嘧啶碱,嘌呤,腺嘌呤 adenine,（Ade）,鸟嘌呤 guanine,（Gua）,（二）嘌呤碱是嘌呤的衍生物,碱基的结构特征,碱基都具有芳香环的结构特征。嘌呤环和嘧啶环均呈平面或接近于平面的结构。碱基的芳香环与环外基团可以发生酮式烯醇式或胺式亚胺式互变异构。,三、核苷（nucleoside）,核苷 戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,核糖核苷,腺苷（A）鸟苷（G）胞苷（C）尿苷（U）,脱氧核糖核苷呢？有几种？是哪几种？跟以下结构有何区别？,区别：1、核糖要变成脱氧核糖；2、U被T代替。种类：同样是4种，但它们是dA、dG、dC、dT,H,H,H,H,CH3,脱氧胸苷,脱氧腺苷,脱氧鸟苷,脱氧胞苷,核苷酸是核苷的磷酸酯。作为DNA或RNA结构单元的核苷酸分别是5-磷酸-脱氧核糖核苷和5-磷酸-核糖核苷。,四、核苷酸 定义、连接方式、种类、衍生物,多聚核苷酸（核酸）,多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3-OH 与另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,聚合酶,核酸的一级结构是通过3,5-磷酸二酯键连接的核苷酸序列。DNA和RNA的生物合成都是按照53方向进行的，没有特别指定时，核苷酸序列都是按照53方向读写。,磷酸二酯键,核苷酸的衍生物,ATP是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生物。ATP的结构：,1、ATP(腺嘌呤核糖核苷三磷酸),核苷一磷酸可以进一步磷酸化，形成核苷二磷酸和核苷三磷酸。下图给出了腺苷一磷酸（AMP）、腺苷二磷酸（ADP）和腺苷三磷酸（ATP）的结构。,P,-O,O,O,腺苷-5-磷酸,ATP的性质：,ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。ATP水解时,可以释放出大量自由能。ATP 是生物体内最重要的能量转换中间体。ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。ATP 也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化反应的底物可以是普通的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。,结构：,cGMP,cAMP,2.环化核苷酸cAMP 和 cGMP,1、核糖体RNA（rRNA）,占细胞RNA总量的80%，与蛋白质（40%）共同组成核糖体。,第二节 RNA的结构,一、RNA的类别及分布,2、转移RNA（tRNA）,tRNA约占RNA总量的15%，主要作用是转运氨基酸用于合成蛋白质。,tRNA分子量为4S，1965年Holley 测定AlatRNA一级结构，提出三叶草二级结构模型。,3、信息RNA（mRNA）mRNA约占细胞RNA总量的35%，是蛋白质合成的模板。真核生物mRNA的前体在核内合成，包括整个基因的内含子和外显子的转录产物，形成分子大小极不均匀的RNA。,第二节 RNA的结构,二、RNA一级结构的慨念（和蛋白质比较学习，即把蛋白质的一级结构拷过来就行了）组成蛋白质的氨基酸的连接方式及其排列顺序。先看RNA的连接方式：,RNA,核苷酸,3,5,1,P,P,P,OH,A,U,G,pGpUpAOH,pG-U-A,pGUA,？键,连接方式是3/、5/磷酸二酯键,形成的化合物叫核苷酸的缩合物：二核苷酸（某某碱基二核苷酸）多核苷酸链,排列顺序是核苷酸的数量、比 例和排列次序,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羟基端（常用3-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。,多聚核苷酸的表示方式,DNA RNA,5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU,第二节 RNA的结构,RNA一级结构研究最多的是tRNA、rRNA以及一些小分子的RNA。其中tRNA分子具有以下特点：分子量25000左右，大约由7090个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。分子中含有较多的修饰成分。3-末端都具有CpCpAOH的结构。,三、RNA一级结构的特点,大多数真核细胞mRNA在3-末端有一段长约200个残基的多聚腺苷酸（Poly A）真核细胞mRNA的5-末端有一极为特殊的帽子结构，称为“帽子（Cap）”：m7GpppNm,AA.AA,200APoly A,3-端,5-端,帽子结构,编码区,mRNA一级结构的特点：,第二节 RNA的结构,RNA是单链分子，因此，在RNA分子中，并不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成突环。这种结构可以形象地称为“发夹型”结构。在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA中严格。G 除了可以和C 配对外，也可以和U 配对。G-U 配对形成的氢键较弱。不同类型的RNA,其二级结构有明显的差异。tRNA中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部分,四、RNA的高级结构,RNA分子是含短的不完全的螺旋区的多核苷酸链。,主要特征：1.一臂四环：氨基酸臂：3端有CCAOH的共有结构；反密码环：环上的反密码子与mRNA相互作用；D环：其上有二氢尿嘧啶（D），与识别酶有关；TC环：含有T和，与识别核糖体有关；可变环：其上的核苷酸数目可以变动；2.含有修饰碱基和不变核苷酸，修饰碱基约为10%。,（一）tRNA的二级结构,在三叶草型二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的tRNA的三级结构均为倒L型,（二）tRNA的三级结构,第三节 DNA的结构,一、DNA的一级结构,因为DNA的脱氧核苷酸只在它们所携带的碱基上有区别，所以脱氧核苷酸的序列常被认为是碱基序列（base sequence)。通常碱基序列由DNA链的53方向写。DNA中有4种类型的核苷酸，有n个核苷酸组成的DNA链中可能有的不同序列总数为4n。,pAGTOH,P,第三节 DNA的结构,二、DNA的双螺旋结构,1953年，Watson 和Crick 提出。,1951年 Franklin和 Wilkins利用X-射线衍射方法分析了DNA的晶体，得到了DNA X-射线衍射图。从衍射图推测出DNA的结构是一个螺旋结构，螺旋沿着螺旋的长轴有两个周期性，第一个周期出现在0.34nm，第二个周期出现在3.4nm。这对于确定DNA的结构是至关重要的线索。,DNA晶体 X-射线衍射图,一双螺旋结构的主要依据,（1）Wilkins和Franklin发现不同来源的DNA纤维具有相似的X射线衍射图谱。,（2）Chargaff发现DNA中A与T、C与G的数目相等。后来Pauling 和Corey发现A与T生成2个氢键、C与G生成3个氢键。,（3）电位滴定证明，嘌呤与嘧啶的可解离基团由氢键连接。,（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为53，而另一条链的方向为35，螺旋结构上有大沟和小沟。,注：在这些沟内，碱基对的边缘是暴露给溶剂的，所以能够与特定的碱基对相互作用的分子可以通过这些沟去识别碱基对，而不必将螺旋破坏。这对于可以与DNA结合并“读出”特殊序列的蛋白质是特别重要的。,二双螺旋结构模型要点,（2）嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧，彼此以3-5 磷酸二酯键连接，形成DNA分子的骨架。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90角。,2.DNA双螺旋结构的要点,（3）螺旋横截面的直径约为2 nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，相邻核苷酸的夹角为36。沿螺旋的长轴每一转含有10个碱基对，其螺距为3.4nm。（即螺旋旋转一圈）高度为3.4 nm。,（4）双螺旋内部的碱基按规则配对，碱基的相互结合具有严格的配对规律，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）结合，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。双螺旋的两条链是互补关系。,三双螺旋结构的稳定因素,主要是：1、氢键（比较弱）；2、碱基堆积力（base stacking force，由芳香族碱基电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心，是稳定DNA最重要的因素；另外还有：3、离子键（减少双链间的静电斥力）。,四DNA双螺旋的构象类型,B-DNA：92%相对湿度，接近细胞内的DNA构象，与Watson 和Crick提出的模型相似。,A-DNA：75%相对湿度，与溶液中DNA-RNA杂交分子的构象相似，推测转录时发生BA。其碱基平面倾斜20，螺距与每一转碱基对数目都有变化。,Z-DNA：主链呈锯齿型左向盘绕，直径约1.8nm，螺距4.5nm，每一转含12个bp，只有小沟。B-DNA与Z-DNA的相互转换可能和基因的调控有关。,C-DNA：66%相对湿度，螺距3.09nm，每转螺旋9.33个碱基对，碱基对倾斜6。可能是特定条件下B-DNA和A-DNA的转化中间物。,双螺旋DNA的结构参数,三、DNA的三级结构,定义：DNA的三级结构指DNA分子（双螺旋）通过扭曲和折叠所形成的特定构象。包括不同二级结构单元间、单链与二级结构单元间的相互作用以及DNA的拓扑特征。超螺旋是DNA三级结构的一种类型。超螺旋即DNA双螺旋的螺旋。,用两手分别捏住线性DNA分子的两端，捻动其中的一端或两端同时向相反的方向捻动。当向右捻动时（即沿右手螺旋方向捻动），等于紧旋（所谓的“上劲”）。处于这样状态的DNA分子相对于它的松弛状态是一种超过原有旋转状态的状态，所以称为过旋。当将处于松弛状态（B构型）的双螺旋向左捻动时（即沿右手螺旋相反方向捻动），等于解旋（所谓的“卸劲”）。处于这样状态的DNA分子相对于它的松弛状态是一种没有达到原有旋转状态的状态，所以称之欠旋。当将线性过旋或欠旋的双螺旋DNA连接形成一个环时，都会自动形成额外的超螺旋来抵消过旋或欠旋造成的应力，目的是维持B构象。过旋DNA会自动形成额外左手螺旋，而欠旋形成额外右手螺旋，称为负超螺旋。,向左捻,向右捻,松弛型,正超螺旋,负超螺旋,环状DNA的拓扑学特征,第四节 核酸及核苷酸的性质,一、溶解性,DNA在PH4.2时溶解度最低。RNA在PH2-2.5时溶解度最低。,1.水溶性,微 溶于水，不溶于有机溶剂,水中溶解度DNA达2%，RNA达4%,2.盐溶性,DNA-蛋白，溶于1mol/L Nacl，低盐不溶。RNA-蛋白，溶于0.14mol/L Nacl，高盐不溶。,3.不同PH的溶解性,二、核酸的紫外吸收特性,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。以A260/A280进行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光,三、核酸的变性与复性,（一）.变性,生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）变性因素:pH（11.3或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛），低离子强度 加热,1.变性的概念,2.变性表征,稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。,核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少3040%，当核酸变性或降解时光吸收值显著增加（增色效应），但核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。,DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在85-95C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)*2.44,热变性和Tm:,影响Tm的因素：,（1）G-C的相对含量（G+C）%=（Tm 69.3）2.44,（2）介质离子强度低，Tm低。,（3）高pH下,碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力。,（4）变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。,（二）.核酸的复性,将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。退火温度Tm25,1.复性的概念,变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。,DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应,2.退火温度,3.复性影响因素,片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/纯度/溶液离子强度,（三）.核酸的复性与分子杂交,分子杂交,定义：在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成氢键，或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程。,探针：用放射性同位素或荧光标记的DNA或RNA片段。,原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，能准确反映出核酸所在的位置在组织细胞中的功能状态。,点杂交：将核酸直接点在膜上，再与核酸杂交。,Southern印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。,Northern印迹法：将电泳分离后的RNA吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。,