《抗生素应用》PPT课件.ppt

1,第三节抗生素应用,2,一、剂量表示法,1、单位（效价单位）指定单位：人为指定(U)活性质量：1mg硫酸阿米卡星的活性质量阿米卡星 585.61000硫酸阿米卡星 781.75多组分抗生素：,749ug,3,二、抗生素应用,1、医疗：感染、肿瘤、降血脂2、农业：植物保护、除草、生长素3、畜牧业：感染、饲料添加剂4、食品保藏：保鲜、防腐5、工业：防霉、提高产量6、科研：标记、动物模型、抑菌,4,(一)抗生素在医疗上的应用,1 控制细菌感染性疾病：疾病得到控制死亡率下降，人寿命延长。2 抑制肿瘤生长：多柔比星，博来霉素，丝裂霉素3 调节人体生理功能：洛伐他丁可降血脂。4 器官移植：免疫抑制剂环孢素。5 控制病毒型感染：核苷类，醌类及大环内脂类。,5,(二)在农业上的应用,1 用于植物保护：链霉素防治柑橘溃疡病。2 促进或抑制植物生长：赤霉素可做植物生长激素，选择性除草作用有茴香霉素，东洋卡霉素。,6,(三)在畜牧业上的应用,1 用于禽畜感染性疾病控制：青霉素，链霉素，金霉素，土霉素，四环素，卡波霉素，多粘菌素等2 用作饲料添加剂：可刺激禽畜生长如四环素与大环内脂类等抗生素。为防止人畜交叉感染和耐药性及残留药过高。禽用抗生素结构与人用不同，作用机理相似。体内不吸收，蛋，肉，奶内无残留。,7,(四)在食品保藏中的应用,用于肉，鱼，蔬菜，水果等食品的保鲜。用作保鲜剂与防腐剂的条件为：（1）非医用抗生素（2）易溶于水，对人体无毒（3）不损害食品外观与质量。,8,(五)在工业上的应用,1 工业制品的防霉：防止纺织品，塑料，精密仪器，化妆 品，图书，艺术品等发霉变质。2 提高特定发酵产品的产量：向谷氨酸发酵液中，加入适量青霉素，可提高细菌细胞膜的渗透性，有利于细胞内谷氨酸渗出，提高谷氨酸发酵的产酸水平。,9,(六)在科学研究中的应用,1 用作生物化学与分子生物学研究的重要工具：切断RNA，DNA在特定阶段合成。抑制特定酶系反应等。2 用于建立药物筛选与评价模型：利用链佐星（链脲菌素）建立糖尿病动物试验模型。3 其他试验应用：防止细胞，组织培养的污染，用于动物精液，组织液等保存。,10,第四节 抗生素工业生产工艺,一、抗生素工业性质：1、理论产量难计算 2、生物学变量:菌种、条件 3、提取精制困难,11,一 抗生素工业生产及工艺,1 抗生素的生产方法 2 生物合成法生产抗生素的工艺过程 3 抗生素发酵生产的特点,12,1 抗生素的生产方法,（1）生物合成法（即微生物发酵法）（2）全化学合成法（即化学合成法）（3）半化学合成法（即半合成法）,13,（1）生物合成法/微生物发酵法,利用抗生素的产生菌，在一定的条件（培养基、温度、pH、通气、搅拌等）下使之生长繁殖，并在代谢过程中产生抗生素。然后将抗生素从发酵液中提取、精制、最后获得抗生素成品。,14,目前大多数的抗生素品种，如青霉素、链霉素、卡那霉素等都采用生物合成法。其特点是成本较低、周期长、波动性较大等。,15,（2）全化学合成法/化学合成法,某些抗生素的化学结构已经明确且结构简单时，可采用全化学的方法进行合成制取抗生素。如氯霉素在1947年被发现后，现已全化学合成获得成功。又如磷霉素，目前采用全化学合成法进行生产等。,16,（3）半化学合成法（即半合成法）,半合成法是利用化学方法改造生物合成的抗生素，而获得性能良好的新抗生素的一种方法。,17,一般分为两个阶段进行，第一阶段是通过生物合成法制取某种抗生素；第二阶段通过化学等方法改造原来的化学结构，从而获得一系列新抗生素，以达到扩大抗菌谱、提高疗效、降低毒性副作用或弥补其它缺陷之目的。,18,半化学合成法-举例,例如生物合成法制得青霉素G钾盐，进行裂解反应得到6氨基青霉烷酸（6-APA），再用化学方法在母核6-APA的6位碳原子位置上接上不同侧链，即可得到一系列新型抗生素（即半合成青霉素）。,19,又如先制得头孢菌素C，裂解反应得7氨基头孢烯酸（7-ACA），再用化学方法在母核7-ACA的第7位接上不同的侧链，即得一系列新型头孢菌素（即半合成头孢菌素）。,20,2 生物合成法生产抗生素的工艺过程,现代抗生素工业生产多采用生物合成法进行，其工艺过程大体相同，主要通过下列过程来完成的：生产菌种孢子制备种子制备发酵发酵液预处理及过滤提取及精制成品检验成品包装出厂检验。,21,生产菌种,用微生物发酵方法生产抗生素，首先要有一个性能良好的菌种，从自然界分离到的野生菌种由于生产能力低，往往不能满足工业上的需求。,22,因为在正常生理条件下微生物的代谢调节系统，趋向于快速生长和繁殖，但是生产菌种却需要能够大量积累所需的代谢产物，为此常需采用各种措施来打破微生物的正常代谢，人为控制微生物的代谢，从而大量积累所需的代谢产物。所以工业上常用的菌种都是经过人工选育，具备工业生产要求。,23,性能优良的生产菌种应具备的条件,生长繁殖快，发酵单位高；遗传性能稳定，在一定条件下保持持久的、高产量的抗生素生产能力；培养条件粗放，发酵过程易于控制；合成的代谢副产物少，生产抗生素的质量好。,24,孢子制备,生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验，若符合规定，才能用来制备种子。制备孢子时，将保藏的处于休眠状态的孢子，通过严格的无菌手续，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基上，在一定温度下培养5-7日或7日以上，这样培养出来的孢子数量还是有限的。,25,为获得更多数量的孢子供生产需要，必要时可进一步用扁瓶在固体培养基(如小米、大米、玉米粒或麸皮)上扩大培养。常采用较大表面积的固体培养基进行扩大培养。培养时，需控制适宜的湿度、温度及通风量等条件。,26,种子制备,其种子培养的目的是使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，以便接种到发酵罐中。种子制备有的是从摇瓶培养开始，再接入到种子罐进行逐级扩大培养；有的直接将孢子接入种子罐后逐级放大培养。,27,摇瓶培养过程是否需要和种子扩大培养级数的多少，决定于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。一般情况下，种子制备是在种子罐中进行，扩大培养级数通常为二级。,28,先制备孢子悬浮液，通过微孔差压法或打开接种口在火焰保护下接种，将孢子悬浮液接入一级种子罐，也可采用菌丝接种，接种量一般相当于0.1%2%（接种量的，系指种子罐内培养基量而言）；从一级种子罐接入二级种子罐接种量一般为5%20%。在培养过程中对菌丝形态和生化指标进行分析，确保种子质量之后方可移种。,29,发酵,发酵过程的目的是使微生物大量分泌抗生素。在发酵开始前，有关设备和培养基也必须先经过灭菌后再接入种子。接种量一般为10%或10%以上，发酵期视抗生素品种和发酵工艺而定，在整个发酵过程中，需不断通无菌空气和搅拌，以维持一定罐压或溶氧。,30,在罐的夹层或蛇管中需通冷却水以维持一定罐温。此外，还要加入消沫剂以控制泡沫，必要时还加入酸、碱以调节发酵液的pH。对有的品种在发酵过程中还需加入葡萄糖、铵盐或前体，以促进抗生素的产生。,31,对其中一些主要发酵参数可以用电子计算机进行反馈控制。在发酵期间每隔一定时间应取样进行生化分析、镜检和无菌试验。分析或控制的参数有菌丝形态和浓度、残糖量、氨基氮、抗生素含量、溶解氧、pH、通气量、搅拌转速和液面控制等。其中有些项目可以通过在线控制。,32,发酵过程中主要控制罐温、通气量及搅拌转速、补料、加酸碱、消泡剂、某些专用前体、促进剂或抑制剂的用量。,33,34,发酵液的预处理及过滤,发酵液的过滤和预处理其目的不仅在于分离菌丝，还需将一些杂质除去。尽管对多数抗生素品种在生产过程中，当发酵结束时，抗生素存在于发酵液中，但也有个别品种当发酵结束时抗生素大量残存在菌丝之中，在此情况下，发酵液的预处理应当包括使抗生素从菌丝中析出，使其转入发酵液。,35,（1）发酵液的预处理,发酵液中的杂质如高价无机离子(Ca+2、Mg+2、Fe+3)和蛋白质在离子交换的过程中对提炼影响甚大，不利于树脂对抗生素的吸附。如用溶媒萃取法提炼时，蛋白质的存在会产出乳化，使溶媒和水相分层困难。对高价离子的去除，可采用草酸或磷酸。如加草酸则它与钙离子生成的草酸钙，还能促使蛋白质凝固以提高发酵滤液的质量。,36,如加磷酸(或磷酸盐)，则既能降低钙离子浓度，也易于去除镁离子。如加黄血盐及硫酸锌，则前者有利于去除铁离子，后者有利于凝固蛋白质。此外，这二者还有协同作用。它们所产生的复盐对蛋白质有吸附作用。2K4Fe(CN)6+3ZnSO4K2Zn3Fe(CN)62+3K2SO4,37,对于蛋白质，还可利用其在等电点时凝聚的特点而将其去除（法1）。蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中，胶体粒子的稳定性和其所带的电荷有关。它属于两性物质，在酸性溶液中带正电电荷，在碱性溶液中带负电荷，而在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点；因其羧基的电离度比氨基大，故很多蛋白质的等电点在酸性(pH 4.05.5)范围内。,38,某些对热稳定的抗生素发酵液还可用加热法（法2）。使蛋白质变性而降低其溶解度。蛋白质从有规律的排列变成不规则结构的过程称为变性。加热还能使发酵液粘度降低、加快滤速。例如在链霉素生产中就可用加入草酸或磷酸将发酵液调至pH 3.0左右，加热至70，维持约半小时，用此方法来去除蛋白质，这样滤速可增大10100倍。滤液粘度可降低至1/6。如抗生素对热不稳定，则不应采用此法。,39,为了更有效地去除发酵液中的蛋白质，还可以加入絮凝剂（法3）。它是一种能溶于水的高分子化合物。含有很多离子化基团，如NH2 COOH，OH等。如上所述，胶体粒子的稳定性和它所带电荷有关。由于同性电荷间的静电斥力而使胶体粒子不发生凝聚。絮凝剂分子中电荷密度很高，它的加入使胶体溶液电荷性质改变从而使溶液中蛋白质絮凝。,40,对絮凝剂的化学结构一般有下列几种要求：1)其分子中必须有相当多的活性基团，能和悬浮颗粒表面相结合。2)必须具有长链线性结构，但其相对分子质量(分子量)不能超过一定限度，以使其有较好的溶解度。在发酵滤液中多数胶体粒子带负电荷，因而用阳离子絮凝剂功效较高。例如可用含有季胺基团的聚苯乙烯衍生物，分子量在2600055000范围内。加入絮凝剂后析出的杂质再经过滤除去，以利于以后的提取。,41,（2）发酵液的过滤,发酵液为非牛顿型液体、很难过滤。过滤的难易与发酵培养基和工艺条件，以及是否染菌等因素有关。过滤如用板框压滤则劳动强度大，影响卫生，菌丝流入下水道时还影响污水处理。故以选用鼓式真空过滤机为宜，并在必要时在转鼓表层涂以助滤剂硅藻土。当转鼓旋转时，以刮刀将助滤剂连同菌体薄薄刮去一层，以使过滤面不断更新。,42,另一种设备是自动出渣离心机，但所排出的菌丝滤渣中尚含有较大量的发酵液，因此如要提高过滤收率，可将此滤渣以水洗后再次用同样型号离心机分离。第一次和第二次离心分离液体合并后进入下一工序。,43,再一种设备称倾析器(De canter)。它既可用于固、液相的分离，也可用于固相、有机溶媒相和水相三者的混合和分离，从而将过滤菌丝和溶媒萃取这两步合并在这一设备中完成。这就简化了发酵液后处理工艺，提高了收率，并缩短了生产周期，也节约了劳动力、厂房和成本。,44,抗生素的提取,提取的目的是在于从发酵液中制取高纯度的符合药典规定的抗生素成品。在发酵滤液中抗生素浓度很低，而杂质的浓度相对地较高。杂质中有无机盐、残糖、脂肪、各种蛋白质及其降解物、色素、热原质、或有毒性物质等。此外，还可能有一些杂质其性质和抗生素很相似，这就增加了提取和精制的困难。,45,由于多数抗生素不很稳定，且发酵液易被污染，故整个提取过程要求：1)时间短；2)温度低；3)pH宜选择对抗生素较稳定的范围；4)勤清洗消毒(包括厂房、设备、管路并注意消灭死角)。常用的抗生素提取方法包括有溶媒萃取法、离子交换法和沉淀法等。,46,(1)溶媒萃取法,这是利用抗生素在不同pH条件下以不同的化学状态(游离酸、碱或成盐)存在时，在水及与水互不相溶的溶媒中其溶解度不同的特性，使抗生素从一种液相(如发酵滤液)转移到另一种液相(如有机溶媒)中去，以达到浓缩和提纯的目的。利用此原理就可借助于调节pH的办法使抗生素从一个液相中被提取到另一液相中去。,47,所选用的溶媒与水应是互不相溶或仅很小部分互溶，同时所选溶媒在一定的pH下对于抗生素应有较大的溶解度和选择性，方能用较少量的溶媒使提取完全，并在一定程度上分离掉杂质。目前一些重要的抗生素，如青霉素、红霉素和林可霉素等均采用此法进行提取。,48,(2)离子交换法,这是利用某些抗生素能解离为阳离子或阴离子的特性，使其与离子交换树脂进行交换，将抗生素吸附在树脂上，然后再以适当的条件将抗生素从树脂上洗脱下来，以达到浓缩和提纯的目的。应选用对抗生素有特殊选择性的树脂，使抗生素的纯度通过离子交换有较大的提高。由于此法具有成本低、设备简单、操作方便，已成为提取抗生素的重要方法之一。,49,如链霉素、庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素等均可采用离子交换法。此法也有其缺点，如生产周期长，对某些产品质量不够理想。此外，在生产过程中pH变化较大，故不适用于在pH大幅度变化时稳定性较差的抗生素等。,50,(3)其他提取方法,如直接沉淀法就是提取抗生素的方法中最简单的一种。例如四环类抗生素的提取即可用此法。发酵液在用草酸酸化后，加黄血盐、硫酸锌，过滤后得滤液，然后以脱色树脂脱色后，直接将其pH调至等电点后使其游离碱折出。必要时将此碱转化成盐酸盐。,51,抗生素的精制,产品的精制、烘干和包装阶段要符合“药品生产管理规范”(GMP)的规定。例如其中规定产品质量检验应合格、技术文件应齐全、生产和检验人员应具有一定素质；设备材质不应能与药品起反应、并易清洗，空调应按规定的级别要求，各项原始记录、批报和留样应妥为保存，对注射品应严格按无菌操作的要求等。,52,A 脱色和去热原质,脱色和去热原质是精制注射用抗生素中不可缺少的一步。它关系到成品的色级及热原试验等质量指标。色素往往是在发酵过程中所产生的代谢产物，它与菌种和发酵条件有关。热原质是在生产过程中由于被污染后由杂菌所产生的一种内毒素。各种杂菌所产生的热原反应有所不同。革兰氏阴性菌产生的热原反应一般比革兰氏阳性菌的为强。,53,热原注入体内引起恶寒高热，严重的引起休克。它是多糖磷类脂质和蛋白质的结合体，为大分子有机物质，能溶于水。在280加热4h它能被破坏90%；180200加热半小时或150加热2h能被彻底破坏。它亦能被强酸、强碱、氧化剂(如高锰酸酸钾)等破坏。它能通过一般滤器，但能被活性炭、石棉滤材等所吸附。,54,生产中常用活性炭脱色去除热原，但须注意脱色时pH，温度、炭用量及脱色时间等因素，还应考虑它对抗生素的吸附问题，否则会影响抗生素的产量；此外，也可用脱色树脂去除色素(如酚醛树脂，即122树脂)。对某些产品可用超微过滤办法去除热原，还应加强在生产过程中的环境卫生以防止热原。,55,B 结晶和重结晶,常用的几种结晶方法如下：(1)改变温度结晶 利用抗生素在溶剂中的溶解度随温度变化而显著变化的这一特性来进行结晶。例如制霉菌素的浓缩液在5条件下保持4h6h后即结晶完全。分离掉母液、洗涤、干燥、磨粉后即得到制霉菌素成品。,56,(2)利用等电点结晶 当将某一抗生素溶液的pH调到等电点时,它在水溶液中溶解度最小，则沉淀析出。如6-氨基青霉烷酸(6-APA)水溶液当pH调至等电点(4.3)时，6-APA即从水溶液中沉淀析出。(3)加成盐剂结晶 在抗生素溶液中加成盐剂(酸、碱或盐类)使抗生素以盐的形式从溶液中沉淀结晶。例如在青霉素G或头孢菌素C的浓缩液中加入醋酸钾、即生成钾盐析出。,57,(4)加入不同溶剂结晶 利用抗生素在不同溶剂中溶解度大小的不同，在含抗生素的某一溶剂中加入另一溶剂使抗生素析出。如巴龙霉素具有易溶于水而不溶于乙醇的性质。在其浓缩液中加入1012倍体积的95%乙醇，并调pH至7.27.3使其结晶析出。重结晶是进一步精制以获高纯度抗生素的有效方法,58,C 其他精制方法,其他精制方法包括：(1)共沸蒸馏法 如青霉素可用丁醇或醋酸丁酯以共沸蒸 馏进行精制。(2)柱层析法 如丝裂霉素A、B、C三种组分可以通过氧 化铝层析来分离。(3)盐析法 如在头孢噻吩水溶液中加入氯化钠使其饱 和，其粗晶即被析出后进一步精制。,59,(4)中间盐转移法 如四环素碱与尿素能形成复盐沉淀后再将其分解，使四环素碱析出。用此法以除去4-差向四环素等异物，以提高四环素质量和纯度，又如红霉素能与草酸或乳酸盐或复盐沉淀等。(5)分子筛 如青霉素粗品中常含聚合物等高分子杂质，可用葡聚糖凝胶G-25(粒度2080m）将杂质分离掉。此法仅用于小试验。,60,成品检验,为了保证药物的质量，用药的安全，对抗生素各种成品都必须进行检验。常规检验包括性状及鉴别试验、安全试验、降压试验、热原试验、无菌试验、酸碱度测定、效价测定、水分测定、混浊度测定、色泽颗粒细度测定等等。,61,成品分包装,抗生素原料药除进行成品大包装外，还须由制剂厂（或制剂车间）再进行分包装，如果是注射用抗生素，尚须在无菌条件下，进行小瓶分装以供临床应用。,62,3 抗生素发酵生产的特性,（1）抗生素发酵生产的特点（2）抗生素发酵生产的特殊问题,63,（1）抗生素发酵生产的特点,菌体生长与产物形成的不平行性 理论产量难以用物料平衡来计算 稳定性差,64,菌体生长与产物形成的不平行性（1）,抗生素是其生产菌的次级代谢产物，而不是初级代谢产物，所以抗生素并不是在生产菌体生长繁殖时大量形成的，而是在菌体生长繁殖至一定阶段后才大量合成的。因此抗生素的发酵环节分为菌丝增长繁殖过程和抗生素的分泌合成过程。,65,在发酵中，菌丝太少，当然抗生素产量低，但是菌丝生长繁殖太旺盛，菌体浓度过浓，抗生素的产量并不是相应的最高，即生长与产物形成的不平行性。要提高抗生素产量，一般都是让菌体在发酵初期迅速生长、繁殖，达到菌体浓度后，想尽办法延长第二阶段的时间，即抗生素合成分泌阶段的时间，合成分泌更多的抗生素。,66,理论产量难以用物料平衡来计算（2）,一般的工业发酵中，产物多为微生物利用碳源物质后的代谢产物，其理论产量可以从物料平衡关系中计算出来。化学合成药物生产中，其理论产量更可以通过参加反应物的浓度消耗与生成产物浓度增加的平衡中计算。,67,但是抗生素是产生菌次级代谢的产物。目前对微生物的次级代谢过程和次级代谢变化了解不完全，故抗生素的理论产量难以用物料平衡关系来计算。现在生产中发酵前对抗生素理论产量的预测都是靠经验，根据以前的生产情况作出来的。,68,稳定性差（3）,由于生产菌种的变异退化，发酵所用的培养基成分以及原材料质量，中间代谢的控制，设备条件，操作条件等因素的差异，通常各批发酵所生产的抗生素是不同的，一般波动幅度为10%。,69,由于抗生素的稳定性不同，即使放罐的发酵单位相同，因提炼工艺，操作方法的不同，最终所得抗生素成品产量也会略有差异。有时菌种的退化变异会造成整个发酵过程的失败。所以，要使抗生素发酵生产稳定，就必须努力使生产菌种的遗传性状稳定，设备条件和生产工艺条件稳定，人员的操作规范稳定。,70,（2）抗生素发酵生产的特殊问题,染菌问题 耗粮问题 动力消耗问题 抗生素的稳定性和质量问题,71,染菌问题（1）,抗生素工业生产的第一步就是对抗生素生产菌种进行扩大培养，获取足够数量的菌体，需要多次接种和转种，如果操作不慎，只要一次接种带杂菌，在以后培养抗生素的同时，也培养了带入的杂菌。,72,轻者造成抗生素发酵单位的降低，增加杂质，使提取精制困难，减少抗生素成品的产量；重者造成发酵的失败，迫使“倒罐”。所以杂菌的污染问题是抗生素生产的最严重的问题之一。,73,耗粮问题（2）,在抗生素生产中，要消耗大量的粮食，培养基中的碳原物质和氮源物质均是农副产品，提取抗生素所用的溶剂有的也必须用粮食来生产。有人估计，生产1kg的抗生素要消耗25200kg粮食。因此，在抗生素工业生产中降低粮食的耗费有十分重要的现实意义。,74,降低粮食耗费的主要措施有：选择优良菌种，采用合理的配方，降低杂菌的污染，减少培养基的浪费，改进发酵工艺等。,75,动力消耗问题（3）,抗生素工业生产中要消耗大量的动力，如灭菌，通气搅拌，物料输送，加热过滤，冷却蒸发，干燥等都耗能巨大，如何提高产量，降低消耗，节约能源是一个十分重要的问题。,76,抗生素的稳定性和质量问题（4）,不同的抗生素在不同状态下的稳定性是不同的，有的抗生素在溶液状态下很不稳定，甚至在发酵过程中就一边产生一边分解。在提取中也容易遭到破坏，分解，直接降低了抗生素的产量。,77,分解产物与抗生素混合在一起，在微生物产品中很难除去，降低了产品的质量。因此，要严格控制工艺条件，使抗生素分解最少，提高产量，保证质量。,78,谢谢！,