《抗体标记》PPT课件.ppt

第十五讲,抗体的标记,抗体的纯化原理、方法,抗体分子有一定的等电点、溶解度、核电性及疏水性，可以用电泳、盐析沉淀或其他层析技术进行分离、纯化根据抗体的用途和来源，确定具体的纯化方法标记抗体选择特异性好的亲和柱进行纯化,抗体的预处理,过滤：去除脂质颗粒、纤维蛋白和固体颗粒低速离心：去除细胞残渣及小颗粒物质，适用于 血清、腹水和细菌培养上清二氧化硅吸附：适用含大量脂质的腹水、血清 1.用等量的巴比妥缓冲液稀释腹水或血清 2.加入一定量的二氧化硅粉末，室温搅拌30min 3.2000rpm离心20min，留取上清,抗体纯化亲和层析法,指在柱材基质上共价连接上配体，利用配体与抗体之间可逆的特异性结合反应，在一定条件下，使抗体被柱子保留，而其余蛋白被洗掉，然后改变条件令抗体被洗脱下来常用配体：蛋白A、蛋白G或相应抗原,蛋白A亲和层析法,蛋白A是金黄色葡萄球菌的胞壁蛋白，有6个IgG结合位点，5个与Fc片段有很强的结合能力，且各个位点与抗体的结合都是独立的一个蛋白A至少可以与两个IgG分子结合，适合纯化IgG抗体,蛋白G亲和层析法,蛋白G是G群链球菌的细胞壁蛋白，可与IgG的Fc区域结合比蛋白A亲和力强，但与白蛋白有微弱结合适合纯化IgG抗体,抗体的保存,防止细菌或真菌的污染：叠氮钠和柳硫汞低温存储，忌反复冻融pH在78之间，盐浓度在0150mM抗体浓度110mg/ml为宜不标记抗体可加BSA作为稳定剂,液体保存：抗体无菌处理，加入0.02叠氮钠或柳硫汞，4保存0.51年；或再加入等体积甘油（含3Na2HPO412H2O），4 保存更久低温保存：将抗体分管冻存，于-20 或-70 可存放数年冷冻干燥：适用纯化后的抗体溶液，冻成干粉于4 存放45年,抗体标记技术是指用荧光素、放射性核素、酶、胶体金、铁蛋白及化学（或生物）发光剂等作为追踪物标记抗体进行的抗原、抗体反应，并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上对抗原、抗体反应进行定性和定位研究或应用各种液相和固相免疫分析方法对体液中的半抗原、抗原进行定性和定量测定,抗体的标记,放射性同位素标记荧光素色素标记酶标记生物素标记胶体金标记,荧光素色素标记技术,基本原理：将抗原、抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合，以荧光素作为标记物与已知的抗体结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力，然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原，在荧光灯源紫外线或蓝紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测,荧光：一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供给则发光瞬即停止荧光素：是一种能吸收激发光的能量而产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物要求：具备能与蛋白质分子形成稳定的共价键结合 的化学基团，荧光效率高 标记抗体后不影响抗原抗体的结合反应 标记方法简便 游离的荧光素易与标记后的抗体分离,常用于标记抗体的荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明、四乙基罗丹明FITC标记方法：直接标记法、间接标记法、改良法直接法：稀释抗体至20mg/ml，电磁搅拌510分钟 称取荧光素0.01mg荧光素/mg蛋白 将荧光素加入稀释抗体中，510分钟加完 搅拌1218h，离心，除去少量沉淀物装入透析袋中，用0.01M PBS透析，4过夜 用Sephadex G-25或50过滤，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体,间接法：用4的PBS将抗体稀释至3040mg/ml，置于三角瓶中，放于冰槽中 按0.01mg荧光素/mg蛋白称取荧光素，用3重碳酸钠水溶液溶解 抗体与荧光素等量混合，4 结合1824h 离心，除去少量沉淀物装入透析袋中，用0.01M PBS透析，4过夜 用Sephadex G-25或50过滤，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体,改良法：稀释抗体至10mg/ml，降温至4 加入FITC（抗体蛋白：FITC5080mg:1mg），4搅拌1214h 用半饱和硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，再用0.01MPBS透析 将制备好的荧光抗体加0.01叠氮钠，分装保存,透析标记法：pH99.5，抗体蛋白含量1040 mg/ml 1)用0.05M pH99.5的碳酸缓冲液制备浓度为1mg/ml的FITC溶液 2)将10mg/ml抗体溶液对碳酸缓冲液透析过夜 3)搅拌，缓慢滴加一定体积的FITC溶液（抗体:FITC100:1），若pH低于9，用NaOH调节 4)室温，避光搅拌24h；将标记液用PBS溶液透析48h 5)以Sephadex G-25层析柱提纯标记物，除去过量FITC，置于4保存,荧光抗体的鉴定：特异性和敏感性鉴定荧光抗体的保存：4或-20低温保存，最好加入1:500010000的柳硫汞或1:10005000的叠氮钠，分装，真空干燥更易长期保存,放射性同位素标记技术,将被标记物分子中某个原子或几个原子被放射性同位素取代形成同位素标记化合物，是将同位素分析的高灵敏度于与抗原-抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法特异性强、灵敏度高、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化,可利用其衰变时放出的放射线进行测量，测量较灵敏而方便H3,C14,I131,I125H3,C14：不改变抗原的结构及其免疫学活性，标记的抗体可长期使用，标记繁琐，测定麻烦方法：氯胺T碘化法和Indogen包被法,氯胺T法：原理：氯胺T是一种氧化剂，在水溶液重产生次氯酸，可使带有负电荷的放射性碘离子氧化成碘分子，使产生的自由碘分子与蛋白质中的酪氨酸残基（少量的组氨酸残基）发生卤化反应使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链，然后和被测物反应，生成带有放射性的化合物 优点：标记效率高，重复性好，试剂便宜易得,步骤：在细胞冻存管内加入纯化的100g/100 L McAb，再加入10 L0.05MPBS，再加入10 L I125 加入10 L 氯胺T，迅速振荡，室温下反应40s 加入100 L 还原剂偏重亚硫酸钠 加入200 L KI溶液 将碘化反应混合液注入PD10柱，洗脱保存：加入1/8体积的异丙醇，分装，置于铅罐重-20储存备用，避免反复冻融,酶标记技术,通过共价键经适当方法将酶联结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，这些有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观查，也可以用分光光度计测定，呈色反应显示了酶的存在，从而证明了发生了相应的免疫反应,常用于标记的酶：辣根过氧化物酶(HRP)：由主酶和辅基结合而成的过氧化物酶，能催化过氧化物（H2O2）对某些物质的氧化，释放出的氧将无色的供氢体(OPD,TMB)氧化成有色的产物 碱性磷酸酶（AKP）：作用于底物，形成磷酰基-酶的中间产物，再进一步将磷酰基转变为无机磷,戊二醛（GA）交联法：GA是一种双功能基团试剂，通过醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-GA-免疫球蛋白结合物，适用AKP1）用100mol/l Ph6.8的PBS稀释GA至终浓度为0.15 mol/l2）将10mgHRP溶于0.2ml上述GA溶液中，室温下搅拌反应18h,3）PBS透析过夜，过Sephadex G-25凝胶柱，收集流出的棕色液体，浓缩至1ml4）将5mg抗体溶于1ml PBS，加入上述液体终，并加入0.1ml，pH9.6，1M的碳酸盐缓冲液5）4反应24h，然后加入1ml,1M,pH7.0的赖氨酸溶液，4继续反应2h6）PBS透析过夜7）过Sephadex G-200层析柱，分管收集，将A280 nm的第一峰收集，-20 冻存,改良过碘酸钠法：过碘酸钠将HRP表面的糖分子氧化为活泼的醛基，可与蛋白质上的氨基形成希夫碱，后者可用NaBO4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记物1）将5mgHRP溶于1ml蒸馏水中2）加入0.2ml新配制的0.1M过碘酸钠溶液，室温避光搅拌20min,3）1mM（pH4.4）醋酸钠缓冲液透析，4过夜4）加20l，0.2M（pH9.5）碳酸盐缓冲液，使以上醛化的HRP的pH升高至99.5，然后立即加入10mg抗体，避光室温搅拌2h5）加入0.1ml新配的4mg/ml NaBO4溶液，混匀，4，2h6）0.15M（pH7.4）PBS透析，4过夜,胶体金标记抗体,是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原-抗体反应的一种新型免疫标记技术胶体金是由氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态 结合力与溶液pH和蛋白质等电点有关,pH等于或稍偏于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子于胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，轻易吸附于金颗粒表明在低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，两者极易静电结合形成大的聚合物pH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互排斥而不能互相结合,透析除盐：除去蛋白质中多余的电解质去除蛋白质中的沉淀：离心标记：用K2CO3或HCl调节金溶液至所需pH 加入最佳标记量的蛋白质溶液，电磁搅拌23min加入1PEG20000至终浓度0.05 10000100000g离心3060min,吸取上清 将沉淀悬浮于含0.20.5mg/mlPEG20000溶液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，加入叠氮钠，4保存 用Sephadex G-200柱进行纯化，用0.1BSA洗脱,生物素标记技术,原理：生物素的琥珀酰亚胺同抗体的自由氨基反应特点：不影响标记抗体的生物活性 结合快速，具有高度特异性和稳定性,