《技术育种》PPT课件.ppt

第3章 新技术育种原理及其进展,菌种选育 应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。,菌种选育的目的是为了不断提高发酵工业产品的产量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。,菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。,自然选育诱变育种杂交育种 基因工程育种原生质体融合育种,菌种选育方法,（一）自然选育,在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。,自发突变(spontaneous mutation)，也称自然突变，指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。,一般认为引起自然突变有两个原因：（1）多因素低剂量的诱变效应；（2）互变异构效应。（1）多因素低剂量的诱变效应是指自然突变实际上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，例如充满宇宙空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质（如过氧化氢等）,一、遗传育种,（2）互变异构体（tautomers）的存在引起碱基的错配。C与A、T与G、A与C、G与T配对。复制时可引起碱基对的转换。在DNA复制中错误引起的突变。,自然突变两种情况：生产上所不希望的：菌种的衰退和生产 对生产有益的：生产性能提高,质量下 降,制备单孢子（单细胞）悬液 适当稀释在固体平板上分离挑取部分单菌落进行生产能力测定经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株,自然选育的一般程序：,自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。,（二）诱变育种,诱变育种就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺。,目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。以青霉素为例，1943年开始生产时的效价仅为20U/ml，通过多次诱变育种现已达50000-100000U/ml。虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目前广泛使用的育种手段。,基因突变的类型（根据遗传信息的变化）,原序列 5-AUG CCU UCA AGA UGU GGG Met Pro Ser Arg Cys Gly(1)同义突变 5-AUG CCU UCA AGA UGU GGA Met Pro Ser Arg Cys Gly(2)错义突变 5-AUG CCU UCA GGA UGU GGA Met Pro Ser Gly Cys Gly(3)无义突变 5-AUG CCU UCA AGA UGA GGA Met Pro Ser Arg(4)移码突变 5-AUG CCU UCA AGU GUG GG Met Pro Ser Ser Val,诱变育种原理,1、诱变育种的诱变剂,凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称诱变剂。,如紫外线、X-射线、-射线、快中子、超声波等,诱变剂,物理诱变剂化学诱变剂生物诱变剂,噬菌体、转座子,2、诱变育种的基本方法,原始菌株（出发菌株）,诱 变 育 种 的 工 作 程 序,诱变部分,筛选部分,（1）、出发菌株的选择,选择时注意以下几点：,1）选择对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株作为出发菌株。,2）最好选用已经过生产选育的自发突变菌株。,3）采用具有有利性状的菌株作为亲本，如生长速度快，营养要求低等。,4）由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏感性提高，故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发菌株。例如，在金霉素生产菌的诱变中，失去（黄色）色素的变异菌株作为出发菌株则产量会不断提高。,（2）、单细胞（或单孢子）悬液制备,一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理。？,因为 1）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂 2）可避免长出不纯的菌落。,处理前，细胞应尽可能达到同步生长状态 细胞菌龄一般在对数期，,霉菌的菌丝一般是多核的，所以对霉菌的处理一般应采用孢子悬浮液。,紫外线(Uv),使用历史较久、廉价、危险性小、效果好，应用较广 对诱变最有效的波长是260nm左右(253-265nm)作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性,造成菌体变异甚至死亡.,诱变剂的选择与剂量确定？,（3）、诱变发生的比较,快中子,中子是不带电荷的粒子，可由回旋加速器、静电减速器或原子反应堆产生。中子不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核射出质子，因而快中子的生物学效应几乎完全是由质子造成的。中子分为快中子和慢中子。快中子的能量为0.2-10百万电子伏特，慢中子能量为1/4至100电子伏特。慢中子的效应同射线、射线和电子等照射时引起的基本相同，快中子较X射线、射线具有较大的电离密度，因而能更多地引起点突变和染色体畸变。,氮 芥,氮芥为极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色粉末，一般使用的是其盐酸盐。应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠其作用，释放出氮芥子气，再与细胞起作用而造成变异。氮芥的诱变机制是它能引起染色体畸变。是被使用得最早的一种诱变剂。,亚硝酸,常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基。,亚硝酸A H（次黄嘌呤）C UG X（黄嘌呤）,亚硝酸很不稳定，容易分解成水和硝酸酐，硝酸酐继续分解放出NO和NO2。所以，可在临用前将亚硝酸钠放在pH4.5的醋酸缓冲液中，使先生成亚硝酸然后再使用。,亚硝基胍(NTG),是亚硝基烷基类化合物，可诱发营养缺陷型突变，不经淘汰便可直接得到12%至80%的营养缺陷型菌株，有超级诱变剂之称。在缓冲液中较难溶解，而在甲酰胺中溶解度较大，因此用甲酰胺溶解，可以提高处理浓度。通常在浓度为30ug/ml、温度为28C和时间为60min的条件下进行处理，容易得到高产菌株。,诱变剂的选择,1碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。2亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。,3吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。,剂 量,确定诱变剂后，诱变剂剂量的选择也是育种工作的一个关键问题。,对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。,目前的处理剂量已从以前采用的死亡率90-99.9%降低到70-80%，甚至更低的剂量，特别是对于经过一再诱变的高产菌株。,剂量似乎也不宜过低，因为在使用高剂量诱变时，除个别核被诱发变异外，还可以使其它的核破坏致死，最终能形成较纯的变异菌落；另外，高剂量可能引起遗传物质的巨大损伤，产生回复突变少，促使变异后菌株的稳定。,凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量。,4、诱变剂专一性,诱变剂诱导的碱基对取代的专一性已在大肠杆菌中进行了广泛的研究。NTG诱导的突变99%属碱基转换，其中95%是GCAT的转换。甲基磺酸乙酯诱发GCAT转换突变。4硝基喹啉1氧化物以90%的概率诱发GCAT的转换。紫外线诱发了各种各样的突变，但它太弱，对放线菌不太有用。无化学诱变剂能以诱发AT CD的颠换作为主要的诱变方式。,处 理 方 法,诱变剂的复合处理及其协同效应,使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射进行工作时，设备费用大，并要注意安全性。3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。,3、诱变处理后的后培养,表型迟延现象 生理性 分离性,遗传物质经诱变处理后发生的突变，必须经复制才能表现出来。研究表明，诱变后的一小时内必须进行新的蛋白质合成，这个变异才有效。方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。,（二）基因工程育种,基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。这种技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。,1973年科恩(Cohen,S.)等人进一步将酶切后的外源DNA 片段与质粒DNA链接起来,构成一个重组质粒(recombinant plasmid),并将这个重组质粒转入大肠杆菌细胞。这些开创性的工作为基因工程建立了一套完整的方法和体系,成为现代生物学发展史上的重要里程碑。人们能在分子水平上对微生物的初级代谢和次级代谢生物合成中所涉及的各种基因进行深入的研究并进行定向改造，从而大大推动了菌种改良的进程。通过重组DNA技术提高次级代谢产物产量的主要方法包括:转座突变发生；通过基因工程技术靶向删除和复制基因；通过原生质体融合进行基因重组。,基因工程菌操作程序,1、原理和方法,在一个微生物菌种的初级代谢和次级代谢生物合成途径中，常常有少则几个多至几十个基因参与，其中一些编码了限速步骤的酶，这些所谓的关键酶基因表达量的多少直接与生物合成的速率有关。另外，抗生素等发酵产物的生物合成途径中常会发生旁路代谢，产生一些不需要的副产品或结构类似物，这样，不仅造成生物合成代谢流能量资源的浪费，而且还会对下游的分离纯化和产品的质量带来一定的影响。,S底物P产物B1、B2副产物,从育种的角度考虑，最为重要的是基因的高效表达。？因为目的基因被插入某种载体中，并不意味着这个基因就会表达或能高效表达。因此，选择一个适宜的高效表达系统，才能保证表达产物能够高效表达。,在众多与生物合成有关的基因中，有些属调节基因，调控了各种酶基因的启动和关闭，它们对最终产物的合成往往是至关重要的。而大多数属结构基因，编码了一些酶基因，通过在一个微生物中导入一些特定的外源酶基因，常常能给这个微生物的生物合成增加新的功能，达到合成新化合物的目的。方法：（1）通过基因克隆方法，交换或导入相关基因，通过基因量的增加或调控基因能力的加强提高微生物的合成能力；（2）通过阻断不需要的旁路代谢途径增加主要途径的代谢流，从而达到减少副产品，提高主要产量的目的。,原核生物基因表达的调控,乳糖代谢基因表达调控图解：(没有乳糖时),lacZ,lacY,lacA,调节基因,启动子,操纵基因,结构基因,RNA聚合酶,信使RNA,转录,翻译,阻抑物与操纵基因结合，结构基因转录受阻,阻抑物,原核生物基因表达的调控,乳糖代谢基因表达调控图解：(有乳糖时),lacZ,lacY,lacA,调节基因,启动子,操纵基因,结构基因,信使RNA,转录,翻译,阻抑物与乳糖结合后构象发生了改变，因而不能与操纵基因结合，使得结构基因进行转录。,阻抑物,乳糖,转录,半乳糖苷酶,透过酶,转乙酰酶,乳糖分解代谢调控过程是一个自我调控过程,RNA聚合酶,建立合适的宿主和载体系统基因工程菌的稳定性,基因工程菌在传代中常出现质粒不稳定现象。质粒不稳定可分为两种：分裂不稳定：是指基因工程菌分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌。结构不稳定：是指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失，引起基因工程菌性能的改变。,质粒不稳定的产生原因,质粒不稳定常见的是分裂不稳定。主要与两个因素有关：一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率。二是含质粒菌与不含质粒菌的比生长速率差异的 大小。,含低拷贝数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率高，因此，增加工程菌中质粒拷贝数有利于提高质粒稳定性。,含高拷贝数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质粒的产生，造成含质粒菌比生长速率明显低于不含质粒菌，所以一旦产生了不含质粒菌，能很快地取代质粒菌，因此进一步提质粒拷贝数反而会增加含质粒菌的生长负势，影响质粒的稳定性。,提高质粒稳定性的方法,工程菌的培养一般采用分成两阶段培养法来提高质粒稳定性。第一阶段：第二阶段：,以增加菌体的生长达到一定密度为目的，外源基因不表达，从而使工程菌与质粒丢失菌的比生长速的差异减小，增加质粒的稳定性,诱导外源基因的表达，可以在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长。,2、转座子突变,（1）调节基因插入失活,正负调节元素都能影响次级代谢物的生产，转座子诱导应该是一个破坏调节基因的有用方法。通常，破坏负调节基因能导致高产，而破坏正调节基因会降低产量。可将负调节基因删除并在染色体的中性位点插入正调节基因使其重复来增加产量。,利用转座方法增加目标产物的方法,（2）插入失活竞争性的途径,转座子还可以使竞争辅因子等关键前体的一些途径失活，降低能源。转座子插入诱导的突变谱与诱导剂诱导的不一样，NTG有利于经单一氨基酸取代产生微小的改变，而转座子通过极性效应破坏基因和操纵子，从而导致基因的更改。,（3）随机插入启动子,IS493衍生的转座子具有向外阅读启动子的活性，因此可利用这些转座子在染色体上随机插入启动子。在玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus)中进行的一项转座子诱变的研究表明，Tn5099能诱导导致达托霉素高产的突变。这株突变株的一些表型可归因于可转移的启动子，一些负调节元素的失活或竞争性代谢过程的失活。启动子的随意插入是一个能与其它方法互补的用于菌种改良的强大的新技术。,（三）原生质体融合育种,原生质体融合（protoplast fusion）育种是杂交育种（基因重组）育种的一种特殊方式,通过基因重组可以使基因组成发生较大的改变，随之使生物的性状发生变化。,但对微生物育种来说，有性重组的局限性很大。因为迄今发现有性杂交现象的微生物为数不多，在有工业价值的微生物中则更少；而且即使发生杂交，遗传重组的频率也不高，这就妨碍了基因重组在微生物育种中作用；另外，转化、转导等现象在微生物中亦不普遍。,原生质体融合技术打破了这种不能充分利用遗传重组的局面,1、原生质体融合的概念,就是把两个亲本的细胞分别去掉细胞壁，获得原生质体，将两亲本的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞质融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。,1）、大幅度提高亲本之间重组频率。,原生质体剥离了细胞壁，去除了细胞间物质交换的主要障碍，也避免了修复系统的制约；再加上促融剂的诱导作用，重组频率显著提高。,2）、扩大重组的亲本范围。,2、原生质体融合育种的优点,如天蓝色链霉菌的种内重组频率可达20%,去除了细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换，实现重组，不需要有已知的遗传系统。,3）、原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大。,4）、可以和其它育种方法相结合，把由其他方法得到的优良形状通过原生质体融合再组合到一个单株中。,原生质体融合的基本过程,3、一般步骤,4、原生质体的制备与再生,多用酶解法 细菌、放线菌 溶菌酶 酵母菌 蜗牛酶 霉菌 纤维素酶等,5、影响原生质体制备的因素：,1）菌体的预处理,在使用脱壁酶处理以前，先用某些化合物对菌体进行预处理，有利于原生质体制备。,如 EDTA（乙二胺四乙酸）、甘氨酸、青霉素、D-环丝氨酸等,2）菌体的培养时间,一般选择对数期后期的菌体进行酶处理,3）酶浓度,一般来说，酶浓度增加，原生质体的形成率增大；超过一定范围，则原生质体形成率提高不明显。酶浓度过高，往往导致原生质体再生率降低,建议以使原生质体形成率和再生率的乘积达到最大时的酶浓度作为最适酶浓度。,4）酶解温度,温度对酶解作用有双重影响 一般2040,5）酶解时间,充足的酶解时间是原生质体制备的必要条件；但太长会使再生率显著降低,6）渗透压稳定剂,必须在高渗或等渗溶液中对不同菌种，应采用不同的稳定剂 细菌、放线菌 一般采用蔗糖、丁二酸钠 酵母 采用山梨醇、甘露醇 霉菌 采用KCl和NaCl浓度 一般0.30.8mol/L,6、亲本原生质体融合（和再生）,促融剂常用 聚乙二醇(polyethyleneglycol;PEG)4000 和 6000,PEG可使原生质体的膜电位下降，然后原生质体通过Ca2+交换而促进凝集 PEG渗透压的脱水作用，扰乱了分散在原生质体膜表面的蛋白质和脂质的排列，提高了脂质胶粒的流动性，从而促进了原生质体的相互融合。,电场诱导也可促进原生质体融合,重组能将不同来源的菌株的优点集于一身，创造出性状优异的重组菌来生产重要的生物产品。,7、原生质体融合技术在微生物育种中的应用,已得到较好的应用，例如,二生素链霉菌通过原生质体制备后再生，提高了螺旋霉素产量,酿酒酵母：可利用葡萄糖生产酒精，但不能利用淀粉和糊精 糖化酵母：能利用淀粉和糊精，但产酒精能力很差 二者融合，获得了可利用淀粉和糊精生产酒精的融合子,据报道，至少有五种不同类型的基因控制了代谢物的生产：编码产物合成酶的结构基因；决定结构基因启动和表达的调节基因决定产生菌对自身抗生素耐受性的抗性基因；调节产物进入、外排和分泌的渗透性基因；控制提供前体和辅因子代谢途径的调节基因。,二、变异菌株的筛选技术,同时，微生物代谢产物的高产大致受五个方面的影响：增加前体池增加、修饰和删除调节基因；更改启动子、终止子和/调节子序列；增加编码催化瓶颈反应的酶的拷贝数；去除竞争性的非必需途径。因此，突变处理后，如何从众多的残存菌株中获得所需的突变株成为菌种改良成功与否的关键。,由于经诱变处理后提高产量的变异株仍属少数，所以必须经过大量的筛选工作，才能得到需要的菌株。,通常有两种方法用于筛选改良的微生物菌株：随机筛选和理化性选择此外突变株的筛选可以是手工操作也可以是高度自动化。,主要优点是前期投入资金较少，缺点是需花费大量的劳动力和时间。,优点节约劳动力和时间。缺点仪器昂贵,手工筛选,自动化筛选,（一）随机筛选,随机筛选的三个基本原则：突变、选择和分析。即诱变处理后，从残存者中随机挑选菌株进行固体或液体培养，测定它们的产量，选择产量提高的突变株作为下一轮诱变处理的出发菌株。采用的分析方法有：生物鉴定、免疫分析、层析和HPLC等。通常需设计一个筛选程序，使用于发现改良菌株的方法的精确性和选择性最大化，而使在处理未诱变的对照或参照样品时的变异性最小化。进一步影响随机筛选的成功和加快菌株改良的因子还包括所需的产量改进的程度、诱变突变频率、突变选择周期循环所需的时间和分析能力。随机筛选的缺点：效率不高,随机筛选方法：菌种经诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，从中筛选高产菌株。为了提高筛选效率，发展了一些快速筛选方法（包括摇瓶筛选法，琼脂块筛选法等），并归纳出筛选高产菌的培养基选择准则:1、制备一系列含有各种类型营养成分（生长限制因素）培养基；2、避免使用容易同化的碳源或氮源，（引起分解代谢物阻遏）；3、加入缓冲液以减少pH的变化；4、确定含有所需的辅助因子。,（二）理性化选择,随着遗传学、生物化学等学科的发展,人们已逐渐了解重要工业微生物菌种的遗传背景和代谢途径。运用已掌握的遗传学和生物化学方法,科学设计选择性“筛子”，就可以轻易地把大部分不符合要求的菌株经过第一轮预筛就淘汰掉，使具有有效性状的突变株很方便地筛选出来，从而大大提高了筛选效率。这种方法就是理性化筛选。可以通过预先精确设计，使突变型带上某些遗传标记，在外观表型上，突变菌株与大量未突变菌株可以明确区分开来。通过预筛选，就能方便地得到所需类型的突变型，再通过摇瓶试验，确定有潜力的菌株，进一步加以改良，最终得到符合生产要求的高产菌株。这种方法可以大大节省劳动力，提高筛选效率。,四、应用,1、初级代谢产物的生产,已克隆了与青霉素、头孢菌素C和头霉素生物合成有关的全部基因并进行了一些功能研究，为采用基因工程方法改造这些菌奠定了良好的基础。,重组DNA技术用于改良酶主要表现在：将难以生长或遗传学不易操纵的微生物中获得和一些酶在工业微生物菌株中生产。利用基因的多拷贝数、强启动子和高效的信号序列来增加酶产量。在一个安全的宿主中生产从病源性微生物或产毒素的微生物中获得的一些有用的酶。通过蛋白质工程提高酶的稳定性、活性和专一性。,2、次级代谢产物的生产,3、微生物酶,通过重组DNA技术已发展了一些生产氨基酸和维生素的新工艺。,4、聚合物、燃料、食品和饮料5、生物转化,野油菜黄单孢菌（Xanthomonas campestris）重组DNA操纵将黄原胶的产量提高了2倍，并将丙酮酸盐的含量增加了45%。利用重组DNA技术可将大肠杆菌转换成一株良好的乙醇产生菌（4.3%，体种分数）。利用重组DNA技术可对酿酒酵母进行改造，使它们能产生黑曲霉的淀粉葡萄糖苷酶，裂解不能发酵的糊精用于生产淡啤酒。,重组巴氏假丝酵母（Candida pasteurianum）能将甘油转化成1，3丙二醇。采用一株重组大肠杆菌获得了将廉价的葡萄糖转化成1，3丙二醇的更经济的艺。,作业：微生物菌种新技术育种的方法有哪些？各个方法的原理及优缺点分别是什么？,