《打造透明大脑》PPT课件.ppt

打造透明大脑,作者：卡尔戴瑟罗斯（Karl Deisseroth）,卡尔戴瑟梦斯是斯坦福大学生物工程学和精神病学教授，因为开创了Clarity和光遗传学技术而获得了2015年生物医学科学Lurie奖。,我们的神经系统就像一块色彩丰富的织锦，由交互连接的线编织而成。轴突，一种从神经元延伸出的细纤维，就是构成大脑的线。借助这种特殊结构，电信号可以从一个神经元传至另一个神经元。长程投射轴突（Long-range projecting axon）类似于纺织品中的经线，可与大脑自身的纬线（即短距离内往复缠绕的轴突）交织在一起，通过传递信号来执行计算功能。,要理解大脑的工作机制，科学家需要破译这幅神经织锦的微观结构（精确到单个轴突）。不过，要搞清楚单个轴突的功能，我们还得从整个大脑入手，因为这样才能完整地呈现个细长轴突的全貌以及它所处的环境。然而，遍布脑部的脂肪分子（脂质），尤其是细胞膜上的脂质分子，会导致成像设备发出的光产生散射，阻碍了我们透过最表层的细胞来观察脑部的深层结构。由于大脑既不像普通织物那样平整，也不透明，要看清脑内轴突的精细结构，我们需要一种全新的工具。,现在，一项新技术为神经科学家开启了察看全脑的大门，借助这项新技术，科学家可以确定大脑中构建复杂神经通路的神经纤维的轨迹，以及它们的分子特性。新方法以一种名为水凝胶（hydrogel）的物质为基础。水凝胶是一种聚合物，它内部形成了三维连接网络，既可保持水份，又可防止自身解体。它常被用来在生物组织内部构建3D聚会物骨架。,整个过程分为3部，首先是让凝胶在实验动物或死者的脑内形成，这种凝胶可与蛋白质和核酸（脱氧核糖核酸和核糖核酸）等连接，从而保护这些富含生物信息的关键分子；然后，去除脑中不必和会散射光的组分（比如脂质）；最后，向整个脑结构中引入大量荧光标记和其他标签（凝胶不仅要透明，还要容易注入探针标记），标记发光后，科学家就能以极高的分辨率，直接观察整个脑部中不同的神经纤维和分子。,新技术可以让科学家更深入地了解人体的指挥中心，也让他们得到了很多新发现。借助这种方法，神经科学家能将神经通路与相应的行为学功能联系起来，包括运动、认知等躯体行为和认知行为。新方法还可以帮助科学家更好地研究帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、自闭症、药物滥用、恐惧症与焦虑症的发病过程。我们甚至协助创办了一家公司，以探索组织一水凝胶（tissue-hydrogel）工程在癌症诊断方面的应用。目前该方法除了应用于脑部，还应用到了脑以外的其他身体器官和组织。,透明大脑让大脑变得透明是如此艰难，以至于大型动物历经上亿年演化，仍然没有获得这个特性。很明显，拥有隐形的身体优势多多，所以某些物种会演化出一定程度上透明的身体，以适应生活环境（比如躲避天敌）。为了更好地隐藏自己，某些鱼甚至放弃了血红蛋白，没有红色的血液。然而，尽管生存压力巨大，这些动物也做不到让中枢神经系统完全透明。在那些所谓的透明鱼或虾体内，神经系统仍然保持着不透明尽管已经达到弃用血细胞的演化高度，却依旧无法让光畅通无阻地穿透一个活体生物的大脑。,脑部的这种不透明性，是由于神经组织对光的散射造成的，在脂肪和水的界面，光子会发生漫反射（因为光这两种物质中的传导速度不同，同时神经连接结构极具复杂性）。我们很难通过基因改造或借助演化的力量，消除这一阻碍光线通过的壁垒。构成细胞膜和脑细胞内部结构的脂质屏障，就像绝缘体，在离子沿轴突传递信息的过程中起着非常关键的作用。颇有讽刺意味的是，生物学家最希望能够整体研究的器官（脑），也最难做到透明。,2009年，我开始转向研究这个难题使完整、成熟的哺乳动物的脑部变得透明可见，同时对脑内多个分子进行精细标记。那个时候，全世界已有数百个实验室开始使用我和同事在2004至2009年发明的光遗传学方法（即用光照控制脑细胞活动，打开或关闭特定神经通路组件）。,光遗传学是一门跨学科的科学，可以同时利用激光、光纤和光敏蛋白基因（也叫微生物视蛋白，主要存在于藻类和细菌中），在动物跑、跳、游泳、日常生活以及完成复杂行为时，精确控制活体生物脑内特定细胞的神经活动。2004年7月，我们第一次在神经元上试验了微生物视蛋白。5年后，也就是2009年夏天，光遗传学的主要问题已经很大程度上得到了解决，成为了一项操作简便、广泛使用的技术。尽管通过光遗传学这种方法，神经科学家已经发现了上千种与行为相关的神经机制，但光遗传学并不能提供另一种重要的信息：一个个受控于光线的神经细胞，在大脑里是如何连接的？如果只有光遗传学技术，我们没法弄清楚这个问题。,对很多科学领域来说，如果既能掌握一个系统的整体情况，又能搞清楚单个基础组件的连接方式，将是十分令人期待的，但这是一个有些奢侈的梦想。从复杂系统中分离出单个组件进行独立的分析非常有必要，因为从整体当中分离出一部分，有助于确定哪些特性是不依赖其他部分而固定存在的。但是，对于大脑这种具有无数连接的结构来说，将系统分拆，就像拆下织锦上所有的丝线那样，并不是研究大脑整体功能的最佳策略。,长期以来，由于成年哺乳动物的大脑不透明，要想实现可视化并进行标记，只能对它加以拆分，目前主要是通过切片技术，将三维脑组织分割成上千个二维脑切片。这个过程需要耗费大量的时间和财力，特别是当要对多个脑子进行研究，以形成有意义的统计学结果时（这在研究哺乳类动物行为时经常见到）。而且，在切片的过程中，关键信息也不可逆地丢失了。由于我们已经能够利用光遗传学技术，在大脑内实现一些新技术，因此在2009年，我们开始思考，还能在大脑里做些甚么，来解决大脑可视化这个问题。,历时15年的探索这个想法的种子早在15年前就已经播下了。20世纪90年代中期，我已经开始痴迷于在实验室内用单个细胞构建脑样通路：一种方法是在高分子聚合物支架上培养神经干细胞，进而通过诱导，让其转化为神经元。因为水凝胶的生物兼容性和透明性特别适合作为支架，所以为了实现这一目标，我开始钻研水凝胶相关的自然科学和工程学领域的文献。,接下来数年，我最终完成了简单的前期实验，即在聚合体支架上培养干细胞，并将其转化为神经元，但是从来没有实现从单个细胞得到完整的脑样结构这真是一个魔鬼般的挑战。在接下来的15年，我从一个实验室辗转到另一个实验室，事业上也一步步稳扎稳打（1998年获得神经科学博士学位，随后完成了精神病学住院医师培训和博士后工作，2004年在斯坦福大学建立了实验室），但我一直携带着那些日渐陈旧、仔细装订好的标有水凝胶字样的文件。,好在思想的构架还在，随着一些杰出人才在关键时刻加入我的实验室，这个想法慢慢得到完善，并最终逐渐形成了构建透明大脑的切实可行且易于操的方案。经过长期思考大脑的可视化问题后，我在2010年2月画了一张草图，描述了我的基本想法（参见上页插图）。这时，我的想法和最初的构想相反，我们不是从水凝胶开始，再在其中构建一个大脑，而是从大脑开始，然后在大脑中形成水凝胶。作为一种支撑结构，水凝胶可以使脑中关键成分（比如蛋白质和核酸）处在原来的空间位置，同时清除阻碍我们观察脑部深层构造的一切障碍。水凝胶在溶解或消化掉干扰成份时，还可有效防止大脑在结构上坍塌成一锅粥。,最初，我只是想将这些不同领域的人才集合起来，看看他们一起合作能不能迸发出有创意的想法，没想到数年之后这项技术得到了极大的发展和广泛的应用，这也证明了我们当初的想法是可行的。当时，实验室里两位富于创造力和勇气的研究者维维安格勒迪纳鲁（Viviana Gradinaru）和实验室主管查鲁罗摩克里希南（Charu Ramakrishnan），成为了愿意挑战这个艰巨任务的领头人。这项研究极具挑战，风险很大，所以我决定不让全组参加；我相信，以格勒迪纳鲁和罗摩克里希南的经验（两人在其他课题方面已经非常成功），他们能很好地把控风险，即使这个项目最终没有完成，他们也承受得住令人失望的结果。,从2010年初开始，格勒迪纳鲁和罗摩克里希南开始寻找使神经元免受试剂伤害的方法，因为一些试剂会破坏精细的组织结构和细胞膜。从理论上讲，在脑细胞内填充某种能稳定存在的聚合物就能达到目的，在水凝胶的支持下，神经元应该可以保持完整性。,他们两人尝试了多种方案，包括引入编码特定酶的基因，使神经元合成诸如角素（chitin）和纤维素（cellulose）这种能稳定存在的聚合物。最好的方法是在神经元细胞内生成另一种生物高聚物角蛋白（keratin），这个创意是格勒迪纳鲁想到的。她解释说，在神经元中生成的角蛋白能保护细胞结构免于破碎。综上，我们推断，如果用角蛋白稳固神经元内部，用水凝胶固定神经元的位置，再用洗涤剂洗掉脑中的脂质成份，我们就能得到固定于透明水凝胶之中的全脑，从而让科学家有机会在完整的脑子里直接看到神经元和神经通路的结构。,那时候，在完整的大脑中浇筑水凝胶还仅仅只是一个美好的想法。为了尽快让想法变成现实，我决定邀请经验丰富的化学工程师加入我们的团队，我们的研究并没有对外公布，实验室之外没有人了解这个课题，于是我搜索了一下邮箱的收件箱，看是否有恰好有水凝胶专业背景的研究人员申请来我们实验室做博士后研究。一个叫郑光宪（Kwanghun Chung，音译）的名字映入我的眼帘，他是一位非常优秀的化学工程师，来自乔治亚理工学院。郑光宪听说我们正在从事光遗传学和干细胞方面的工作，非常愿意加入我们实验室。,2010年3月初，就在画出草图仅仅数周后，我在犹他州开会间和郑光宪进行了第一次非常简短的电话交流。因为对这个新的研究方向充满信心，我做了一件之前从未做过（以后可能也不会再做）的事在郑光宪没有到过我们实验室参观，我也没有和他面对面交流的情况下，直接邀请郑光宪加入我们团队。神经科学实验室出现了一位化学工程师，这在当时确实是一件非常新奇的事。,到实验室后，郑光宪立即投入到了这项低调而神秘的计划中。2010年底，我们实验室的三人团队已经制作出了小鼠脑的透明块，即使是组织内部百微米深处，含有角蛋白、被水凝胶包裹的细胞也清晰可见，这可比以前的方法深入很多（参见上页图表）。以实验室常用来分离核酸和蛋白质的丙烯酰胺（acrylamide）为基础材料，郑光宪首次制作出了功能完善的水凝胶。利用这种极富创意的水凝胶，我们设计出了凝胶一组织混合物（gel-tissue hybrids），将莹光标记和其他标记直接引入该混合物，就能直接观察保存完好的蛋白质和结构，比如轴突。经过多轮标记后，我们发现角蛋白并不是必需的，仅仅依靠水凝胶就足以使细胞结构保持在原位。,尽管在此之前，汉斯乌尔里克多德特（Hans-Ullrich Dodt）和阿特苏希米亚瓦基（Atsushi Miyawaki）已经使用其他方法（分别是3DISCO和Scale方法）进行了一些开创性的工作，但我们的方法第一次让成年哺乳动物大脑达到了前所未有的透明度，可操作性也非常强。,技术不断升级我们将这种构建水凝胶组织混合物的方法命名为CLARITY（clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging/immunostaining/in situ hybridization-compatible-tissue-hydrogel的缩写）。我们使用的水凝胶是以丙烯酰胺为基础（现在其他实验室也发表了很多其他版本的水凝胶配方），自2013年我们发表该技术以来，仅仅是这一个组织水凝胶技术版本，已经应用于多项基础和临床科学领域的研究（比如用于研究自闭症或阿尔茨海默病患者死后的大脑），以及小鼠脊髓与大脑的研究（例如，探索调控恐惧和焦虑行为的未知脑回路）。,全世界范围内，已经有很多实验室利用项通用技术发表了多篇研究论文，研究人员通常会将新方法和光遗传学手段结合起来使用，了解神经系统的基本构造，研究适应和非适应性（maladaptive）脑回路。以微生物视蛋白为基础的光遗传学技术诞生后，在最初的5年里催生了大量创新性应用，为光遗传学技术开辟了广阔的应用空间。同样，在脑内构建组织水凝胶的技术也经历了这样一个过程，得益于广泛的应用，这种方法在刚出现的几年内，获得了极大的改进和升级。,例如，水凝胶技术最早的版本中有这样一个步骤：施加电场迅速消除与脂质结合的带电洗涤剂粒子。我们进行了多次实践才搞定这个步骤，得以精确控制，因为电压太高会破坏组织。为了解决这个问题，2014年初，拉朱托马尔（Raju Tomer）、布赖恩薛（Brian Hsueh）、叶立（Li Ye）和实验室的所有人一道发表了两篇文章（其中一篇是与我们在瑞典的同事合着的），阐述了这一步骤的简化版本。因为不再需要使用电场，这项技术有了一个新名字被动CLARITY（passive CLARITY）。除此之外，托马尔及其团队还利用片状光照明显微镜的高分辨率快速模式，研发出了专业的脑水凝胶成像技术，让技术可扫瞄一个平面，而不是一个光点，适合对大的水凝胶块进行快速成像。,现在，格勒迪纳鲁和郑光宪已经拥有了属于自己的实验室（分别在加州理工大学和麻省理工学院），在脑水凝胶成像技术方面，两人的实验室也都有新的重大发现。实际上，组织水凝胶成像技术发展得非常迅速，这进步不仅来自于早期就参与研究的人员，还来自其他后期新加入到这一领域的研究人员。格勒迪纳鲁独立开发并发表了适用于整个生物体的被动CLARITY方案（称为PARS）。,除此之外，格勒迪纳鲁和郑光宪还分别开发出了被称为PACT和SWITCH的新的水凝胶配方，现在，全世界范围内已经有许多实验室开发出了新版本的组织水凝胶复合材料。诚然，在寻找可行的水凝胶方案方面，我们实验室仅做弓浅显的探索。2013年，我和郑光宪公开了水凝胶变体候选清单，包括丙烯酸酯、海藻酸盐，还有其他一些候选物质。现在，我的实验室正和其他研究人员合作，希望找出这些聚合物中哪一种更容易被修饰，比如说，与某些要素合后，聚合物能产生可调节的导电性或化学反应性，从而开辟新的可能。,组织水凝胶复合材料带来的另一个挑战，就是该材料会使水凝胶包埋的组织出现大幅体积膨胀，这一点们在2013年和2014年发表的文章中也有提到。当然，在高分辨率成像时，复合材料的这种特性并不会造成甚么问题，不需要人去解决。不管是最初的CLARITY还是后来其他团队研发的类似的脑内水凝胶配方（2014年的PACT/ePACT、2015年的ExM/proExM和2016年的MAP）都会导致膨胀效应。不过，在将透明脑和理论上的脑图谱相比较时，就需要对原始组织进行精确的还原，为此我们研发了将扩大的组织变回到原始大小的方法，可以看作是脑水凝胶成像技术可供选择的最后一步。,在叶立和另一个团队成员威尔艾伦（Will Allen）的帮助下，我们实验室还研发并公布了一款能高速、自动化成像分析的软件，任何人都可以下载使用。同时，我的同事马克特西尔拉维尼（Marc Tessier-Lavigne，当时就职于洛克菲勒大学，现任斯坦福大学校长）的团队创造了新iDISCO方法。报道上述两项研究且互为补充的文章发表在今年同一期细胞（Cell）杂志上。,另外，在更早一些时候，我们团队，包括艾米丽塞尔伟斯特拉克（Emily Sylwestrak）、普里亚拉贾塞修帕斯（Priya Rajasethupathy）和马修赖特（Matthew Wright），已经使用另一种组织水凝胶配方，合成出了可稳定作用于全脑的关键莹光标记（一次可标记多个核糖核苷酸），相关研究也已经发表在了今年3月的细胞杂志上。,能够标记包括核酸（比如RNA）在内的多种类型分子，是水凝胶技术的一个特别优势，开启了基因表达分析的广阔领域。解决了上述所有问题之后（很多问题今年才解决）这项技术已经成熟，可以在全世界范围内推广使用了。,看见大脑深层结构2010年，这项技术还只是纸上的一张草图，仅仅6年之后，它已经成为了一项功能完备、实用性强的技术。我们研发组织水凝胶技术的初衷，是希望用全脑的结构信息作为全脑光遗传学信息的有益补充，现在这个目标已经实现了，包括细胞杂志在今年6月16日发表的一篇文章在内的多篇文章已经过对此进行了报道。,在细胞的那篇文章中，我们的研究团队利用新技术对大脑前额叶皮层进行了研究。前额叶皮层主要负责调节高水平认知过程和情绪，科学家希望能弄清楚这部份脑区的结构，以及它是如何控制多种行为的，以为治疗自闭症、精神分裂症等精神类疾病找到新的思路。随后，叶立、艾伦和金汤普森（Kim Thompson）以及我们团队的所有成员，和包括斯坦福大学骆利群（Liqun Luo）和詹尼弗麦克纳布（Jennifer McNab）团队在内的其他实验室的研究人员一起，首次用光遗传学方法找出了那些能被美食和可卡因激活的前额叶皮层细胞群（迠些神经细胞也负责调控相应的行为反应）。,接着，我们还发现了会被负面刺激（比如厌恶）激活的、互补的前额叶细胞群。最后，我们利用最新的组织水凝胶技术，发现了这两类细胞群在大脑中的连接情况：会对正面刺激作出反应的细胞倾向于与大脑深处的伏隔核（nucleus accumbens）连接（参见文章开篇图），而对负面刺激作出反应的细胞则更多地与大脑深处的外侧缰核（lateral habenula）相连。,就这样，科学家现在已经能通过组织水凝胶方法和光遗传学方法间接地研究整个生物组织，这在以前是不可能做到的，这种新方法将极大地推动基础生物学的进步，提升我们的健康和疾病治疗水平。对于一个复杂的系统，只有充分掌握局部和全局的信息，才能全面地理解它，不论是繁复的织锦还是神秘的脑组织都是如此。今天的神经科学家，能够从收集的大量数据中，了解到丰富多样的有关生物组织的细节，从而窥探到整个器官的结构、分子组成和细胞的活动情况。这必将为我们深入全面地理解脑功能开启一扇大门。,以局部见全局的方法来进行科学研究极具挑战，而且非常罕见，但是意义却非常重大。复杂系统的特性通常源于局部的相互作用，科学系统是这样，织锦的过程也是这样。惟有以全方位的视角，深度扫瞄，才能够弄清每一条线的作用。,全文完,