《微生物转化》PPT课件.ppt

第二十五章 药物生物转化,张驰 副教授,第一节 微生物转化反应概述,生物转化,是指外来化合物在体内，细胞或酶的作用经过一系列化学变化形成其衍生物或分解产物的过程，也成为代谢转化。,生物转化常利用生长中的菌体，休止的菌体，酶，固定化酶以及固定化菌体作为母体进行药物的转化。主要的优点有反应的区域专一性和立体专一性。,早在2500年前的春秋战国时期，人们就已经知道制酱和醋。在宋代，采用老的曲子进行接种酿酒。不过当时人们并没有认识到可以利用微生物来合成化学物质。1864年巴斯德利用乙酸杆菌将乙醇氧化为乙酸。工业化的里程碑是50年代美国普强药厂利用微生物黑根霉的羟化酶将黄体酮转化为11-羟基黄体酮，即对甾体化合物的结构改造。固定化细胞，基因重组等技术的发展，能将几种不同合成基因构建到同一个工程菌中使得一次培养同时进行几步转化反应，使微生物转化在天然药物修饰中发挥更重要的作用。,微生物转化的发展,第一阶段：菌体生长阶段，在该阶段中主要是供给菌体丰富的营养，使其充分繁殖发育。（温度，pH，通气条件，培养及成分。）第二阶段：微生物转化阶段，一般在生长阶段结束时加入底物溶液，有些还需加入诱导剂。,微生物转化的不同阶段,分批培养转化法利用酶进行生物转化应用渗透细胞进行生物转化应用孢子进行生物转化应用固定化细胞进行生物转化应用干燥细胞进行生物转化静息细胞转化法,常用的转化方法,微生物转化实验概要过程如下：选择需要的菌株 培养成熟菌丝或孢子 选择合适的转化方式 转化培养或转化菌丝及孢子悬浮液转化 转化液的分离提取 产品纯化,微生物转化的过程,由有活性中心都和特殊空间结构的酶作为催化剂；酶催化作用的速度极快；在常温常压和中性条件下进行高效转化反应，简化设备，降低成本；生物转化的专一性，故底物不要求很纯（Ex.粗淀粉）转化过程容易调节（简单的用酸，碱，温度，离子调节）转化过程产生杂质少，过程无毒，无臭，无味，可用于食品，医疗。把含酶细胞或酶本身固定在载体上，可使转化过程连续化。酶来源广泛。可以实现化学反应无法做到的转化。,微生物转化的特点,第二节 生物转化反应类型,最为常见的生物转化反应，在甾体药物合成上应用较多。环氧化反应是生物转化中的一个重要类型，C=C经氧化可形成环氧化合物，可生产磷霉素。,氧化反应,许多醛类，无论式脂肪族，还是芳香族，饱和或不饱和，羟基或卤素取代都能被微生物还原成醇。,还原反应,麻黄碱：利用微生物将苯甲醛和乙醛缩合成1-苯基-1-羟基丙酮，再与甲胺缩合，用活性铅还原，得麻黄碱。,缩合反应,可的松脱氢后苯环形成双键，具有较高的抗炎活性。,脱氢反应,该法是降解甾体物质侧链的重要反应。采用链霉菌转化阿魏酸制备香草醛为例。,碳链氧化降解,第三节 微生物转化在药物中应用,甾体指的是固醇或皮质类激素，由于这类激素都含有相同的结构，所以统称 为甾体类激素。甾体在临床上应用十分广泛，解热镇痛，消炎杀菌等。,甾体微生物转化,1950年Kendall,Reichstein与Hench因发现类固醇的消炎作用而获得诺贝尔奖。1952年以化学方法以牛胆汁中的脱氧胆酸为原料合成肾上皮质激素，反应共需31个步骤，产品售价每克$200；1952年利用Peterson利用黑根霉产生的羟化酶将反应过程缩短为3个步骤，产品售价每克$6；1980年使用突变的分支杆菌分解植物油中的固醇以作为原料，产品价格每克$0.46。,甾体合成技术的演进,羟化反应环氧化反应脱氢反应A环芳构化还原反应水解反应,甾体生物转化的类型,羟化反应,孕酮,皮质激素,环氧化反应,A环芳构化,脱氢,甾体生物转化的原理和方法,甾体生物转化的原理不同于氨基酸，抗生素，蛋白质等的发酵。而是利用微生物中特殊的酶对甾体的某一部位进行特定的化学反应获得的产物。在这一过程中为获得较多的转化酶，我们需要确保菌体产酶的最佳条件，诱导所需要的酶，抑制不需要的酶。,在菌体生长期结束后加入甾体底物，由于其不溶于但能溶于可与水按一定比例混溶的有机溶剂，再加入培养液中转化。,根据转化时微生物的状态可分为4种转化方式：生长培养方式：在微生物培养的中后期加入底物，一边培养，一遍转化。静态菌体悬浮方式：菌体充分生长后，离心得到的菌体悬浮在水或适当 的缓冲液中，再加入甾体进行转化。混合培养方式：以A出发转化成B，需要两种以上的酶参与，单独转化费 时费力，所以常采用混合培养的方法，可以一步得到B 省略了中间过滤步骤。固定化方式：一次制成的菌液反复用于转化是可行的，为了避免溶菌，需要将其固定在水不溶载体上进行转化。,影响甾体生物转化的因素,物理因素搅拌：增加搅拌速度，可以增加溶氧使基质均匀，提高转化率。通气：增加氧的溶解，促进菌体生长及生物转化。培养基的组成碳源：常用的有葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，糊精。氮源：（有机，无机金属离子：增加对转化有益的离子，去除负向影响的离子。,产物的分析与分离方法,纯化 需要用适当的与水不溶的有机溶剂将甾体从转化液种提取出来。常用的有氯仿，乙酸乙酯，二氯甲烷等。溶剂的用量需根据产物在转化液于提取液中的分配系数而定。提取时防止乳化。浓缩后利用各种色谱法得到较纯的甾体转化物。分析 转化过程中需要实时监测残余底物及生成产物的量及比例，以确定转化终点。常用紫外分光光度法，HPLC等。,第四节 新技术在微生物转化的中应用,随着现代生物科学和生物技术的迅速发展，以及一些分析测试技术的应用，微生物转化也得到了进一步的发展。基因工程技术、固定化细胞转化技术、双水相转化技术、超声波技术、有机介质微生物转化以及生物反应器等综合应用于微生物转化反应体系，不仅可使转化的效率成倍增长，而且还有可能使整个反应过程连续、自动化。同时，一些分析测试技术如核磁共振、质谱等已经应用于微生物转化的在线检测。,一、基因工程技术在微生物转化中的应用,随着近年来分子生物学的发展，人们对基因工程的认识也逐步加深，这为微生物转化提供了新的思路。基因工程技术的发展和实用化为此开辟了有效途径。只要生物细胞中存在有催化某一生化反应的酶，即使其量微不足道，应用基因重组技术，通过基因扩增与增强表达，人们就可能建立高效表达特定酶制剂的基因工程菌或基因工程细胞，从而进一步构建成新一代的催化剂固定化工程菌或固定化工程细胞。,如，应用DNA重组技术建立了丝氨酸和色氨酸合成酶工程菌，这种工程菌组装的生物反应器可以用甘氨酸和甲醛为原料制造丝氨酸，反应液含丝氨酸超过400gL，再从丝氨酸与吲哚转化生成色氨酸，反应液中色氨酸浓度达到200gL。此外利用基因工程还可以将能进行生物转化的相关酶从微生物、植物甚至动物细胞中克隆出来再导入一个微生物中进行表达，从而产生能对底物进行转化的一系列酶，将原来复杂的几种转化过程缩短为一个转化反应。目前在这方面的研究也是微生物转化的一个趋势，并且具有广阔前景。,二、固定化细胞转化技术在微生物转化中的应用,固定化细胞转化技术自20世纪70年代问世以来已经广泛应用于工业、农业、医学、环境保护、能源开发以及理论研究等方面，并取得了丰硕成果。利用固定化细胞转化技术，省去了破碎细胞提取胞内酶的过程，完整细胞得到固定后，酶活损失较少，活性回收率高，并且保持了细胞内原有的多酶体系，对于一些需要多步催化的反应过程，一步即可完成。被固定的微生物细胞可以是处于生长状态或体眠状态的活细胞也可以是死亡的细胞(但胞内酶的活力仍 存在),在微生物转化过程研究最多的是固定化活细胞包埋技术。常用的包埋材料有聚丙烯酰胺(PAA)、聚氨基甲酸乙酯(PU)、海藻酸盐凝胶、二氧基硅氧烷、葡聚糖凝胶、聚乙烯醇(PVA)等。以海藻酸钙凝胶为例，其制备过程如下：在室温条件下，将一定浓度的海藻酸钠溶液与微生物细胞混合均匀后，滴加到氧化钙溶液中，形成球珠。,Kaul等采用了海藻酸盐固定化生物催化剂(简单节杆菌)和底物(氧化可的松)进行碳一位和二位脱氢反应研究。每个凝胶珠都可以看成是一个小的生物反应器，由于缩短了扩散距离，转化率明显提高，反应结束后细胞还可以回收并重复使用,三、双水相转化技术在微生物转化中的应用,双水相转化技术早期主要用于生物分子和细胞的分离与纯化。这是由于生物产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需要经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固一液分离带来了困难，另外这些产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境特别敏感为了克服这些缺点出现了双水相技术。近年来，该技术开始应用于微生物转化过程为生物催化过程引入了一种全新的反应体系,双水相技术的核心是成相介质的选择以及介质浓度的控制，它直接影响到底物和产物在两相中的分配。双水相体系基本上可以分为两大娄：高聚物-高聚物体系和高聚物-低分子物质体系。,高聚物一高聚物体系是较常用的，典型的例子如在水溶液中的聚乙二醇(PEG)和葡聚糖，当它们浓度达到一定时溶液变浑浊，静止后形成两个液层，上层富集了PEG，下层则是葡聚糖。Flygare等以聚乙二醇、葡聚糖及Brij35组成的双水相体系，利用分支杆菌(Mycobacterium sp.)进行胆固醇侧链降解制备雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)和雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)研究，上层聚乙二醇富集了菌体，使得菌体具有较高的转化活力，转化速率可达到1.0mg(gh)。,四、超声波技术在微生物转化中的应用,超声波是指频率高于2104Hz的机械波。与其他声波一样，超声波可以在弹性介质中传播。因为超声波的波长很短，所以具有很强的定向传播能力。同时由于超声波在液体和固体中传播时吸收衰减很小，因此具有很强的穿透力。根据超声波的使用范围，常可以将其分为两类：一类是高频超声，频率范围为I10MHz，这一类主要用于医学成像和化合物结构的分析；另一类是功率超声，频率范围为1560kHz，主要用于过程强化反应。,应用超声波技术，首先受到机械力的作用，而机械能又可以转化为热能。此外，当声强足够大时，又能产生空化效应。超声波的机械效应包括振动效应和声流效应，指超声在媒介中传播时引起质点振动以及声流对质点的剪切力；超声波的热效应指超声波在媒介中传播的过程中被传播介质吸收转变为热能；超声波的空化效应指超声波激活气泡各种动力学的表现形式。,超声波技术应用于微生物转化过程，主要是涉及固液传质的生物体系。超声波可以产生上述的效应，较常规方法更有效地细化颗粒、增大传质表面。这一过程主要发生于固液两相界面及细胞壁、细胞膜附近的区域。在超声场中，进行微生物转化的环境和菌体均处于不断的振动中。,对于环境而言，可加强分子的扩散效应，加速体系的混匀过程，减少各种代谢在液相中的梯度；对于菌体而言，可降低其细胞内胞液的黏度，提高膜的通透性。阳葵等等报道了采用超声强度，超声方式和时间对绿僵菌(Metarhizium sp)氧化16,17-环氧黄体酮的影响，并对微生物转化体系中的超声效应进行分析，,认为超声使得反应物颗粒细化、增大了固液界面、加速了底物溶解和底物分子的传递；空化效应产生的冲击力对细胞膜通透性发生变化，促进胞内酶的释放及反应物向胞内的扩散。,五、有机介质中的微生物转化,自从Buckland第一次利用有机溶剂四氯化碳(CCl4)为介质，采用诺卡菌(Nocardia sp.)将胆甾醇转化为胆甾烯酮以来，在有机介质中进行微生物转化成为了近几年在该领域的研究热点。因为在有机体系中可以有效地将产物及时分离出来，底物相应得到补充，从而消除底物和产物的抑制作用，提高转化率。此外，由于一些底物或前体在水相中的溶解度很小，通过用有机相作为介质可以大大提供其溶解度，即增加了底物或前体的加入浓度，在一定程度上也提高了转化率。,一般来说，在有机介质中进行微生物转化的过程中，有机溶剂与水形成两相体系。包括有机介质(水不溶性)-发酵液和有机介质(水不溶性)-缓冲液两种类型。Boren等在辛烷发酵液(1：1)组成的两相体系中，将醋酸雄烯通过脱氢黄杆菌(Flavobacterium dehydrogenans)转化为4-雄烯-3,17-二酮，,结果发现利用发酵液作为第二相有利于微生物转化进行，转化率可高达98，产物形成速率约是纯水介质的6倍这是因为在发酵液中辅酶容易再生。孙小梅等应用聚山梨酯一80(吐温80)磷酸钾体系进行微生物转化，利用棒状杆菌将丙烯腈转化为丙烯酰胺，也实现了较高的转化率。但是由于有机介质自身的特点，对菌体和酶的活力影响很大，甚至对微生物转化过程有一定的毒害作用，其作用机理还有待进一步研究。因此，在选择有机介质参与微生物转化时，必须慎重考虑选择有机溶剂的种类和浓度,除此以外有机溶剂跟水混合在一起还可以形成一种特殊的体系微乳液。微乳液是一种热力学比较稳定、光学透明、宏观均句但微观不均匀的混合液，它可以提供一些微生物转化过程所需要的大量的油水界面，同时也促进了水难溶性底物的溶解。,例：Smolders等利用简单节杆菌在磷脂、苯和少量水组成的微乳液中进行16-甲基-莱氏化合物S-21醋酸酯C1，2位脱氢研究，经过反应15h左右，转化率可以达到98(图1 13)。,六、生物反应器的应用,对于任何一十非常有应用前景，小试阶段取得成功的微生物转化反应来说，要实现其工业化规模生产进行其生物反应器研究是非常必要的。例如丙烯腈通过棒状杆菌转化为丙烯酰胺的过程中，先后对搅拌式反应器、填充式反应器、密集多相流反应器以及膜反应器的应用进行研究。发现，应用膜生物反应器进行 丙烯酰胺的微生物转化可以使得连续化生产成为可能，减少了杂质和丙烯酰胺的聚合体，提高了转化液的纯度，减轻了下游精制工序的压力，从而提高了产 品质量和转化率。,此外，随着两相生物转化技术的发展人们对两相生物反应器的开发也逐 步加强。两相生物反应器对于一些水溶性较差或水不溶性的底物的微生物转化，如酯的合成及水解、甾类化台物的微生物转化具有很大的吸引力。因为大多两相反应器都结合了产物的萃取，有利于克服产物的抑制作用，提高转化率。另外，一些有机介质(如四氟化碳)可以作为氧的载体，因此对于那些需 氧较大的微生物转化反应来说，就可以满足对氧的需求。,七、核磁共振、质谱技术在微生物转化中的应用,随着分析测试技术的迅速发展，核磁共振、质谱等在微生物转化过程中也得到了广泛的运用。自从20世纪70年代首次应用于生物催化过程，经过几十年的研究，核磁共振技术现已成为微生物转化反应中一个稳定的在线检测工具，尤其是1H-NMR检测可以给出较多的动力学数据和底物特异性的信息Reisig等对质谱技术在微生物转化过程中的应用进行了系统的研究，认为质谱技术可用于下列几种情况：背景环境较为复杂的微生物转化；产物缺乏适当的发色团或助色团；可能出现几个异构体产物；产率较低；反应需定量等。,总之，微生物转化是微生物学、生物学、化学、遗传工程、过程工程科学等学科的交叉领域，其目标就是通过采用微生物生产人类所需要的化学品、医药、能源等。因此任何在这些学科上的发展都会对微生物转化产生重大影响。除了上述新技术的应用外，在增加底物溶解度、强化传质过程、提高过程转化率方面也取得了一定的效果，还有原生质体转化技术、超临界流体技术、磁场效应等也成功地用于微生物转化过程，并取得了很好的效果。相信随着各学科的迅速发展和研究的深入，可以为微生物转化提供更为广阔的发展空间。,