《循环生理》PPT课件.ppt

1,PHYSIOLOGY OF CIRCULATION,Welcome!,Huirong Liu,MD,PhDDepartment of Physiology,SXMU,2,G蛋白偶联受体自身抗体与心血管疾病,Relation of Autoantibodies against G-Protein-Coupled-Receptors and Cardiovascular Disease,3,寄语一年级研究生受体学概述G-蛋白偶联受体简介G-蛋白偶联受体自身抗体与心血管结构和功能活动的关系,G蛋白偶联受体自身抗体与心血管疾病,4,寄语一年级研究生,尽快完成观念的转变处理好学习与研究的关系明确科学研究的目的注重科研能力的培养尽快进入角色,5,尽快完成观念的转变,从“学生”转变为“科研工作者”从“学习”转变为“研究”“探索”克服现在学生的一些弱点：,缺乏责任感；应试教育和就业问题，缺乏对科学研究的激情；众多“杂事”，众多的“节假日”；社会的浮躁与急功近利。,6,寄语一年级研究生,尽快完成观念的转变处理好学习与研究的关系明确科学研究的目的注重科研能力的培养尽快进入角色,7,思维模式不同,学习 继承，接受；医疗 应用，服务；科研创新，探索；为用而学。,8,Reading after a certain age,diverts the mind too much from its creative pursuits.Any man who reads too much and uses his own brain too little falls into lazy habits of thinking.过了一定年龄阶段后的学习，会太多地转移有利于创造性发挥的精力。任何一个人，如果学习太多，他用大脑进行思考的机会越来越少，进而就会养成懒于思考的习惯。爱因斯坦,9,寄语一年级研究生,尽快完成观念的转变处理好学习与研究的关系明确科学研究的目的注重科研能力的培养尽快进入角色,10,科学研究目的:探索人类认识的未知领域,探索真理；发现新事物，新现象；揭示新规律（阐明规律）；提供新认识(新解释)；科研工作者的工作目的.科研的动力：（1）追求真理（好奇心，认死理，自然科学 的无穷魅力)；（2）社会需求（指挥棒）；（3）功利驱使。,11,寄语一年级研究生,尽快完成观念的转变处理好学习与研究的关系明确科学研究的目的注重科研能力的培养尽快进入角色,12,不要只盯著为毕业发表论文独立科研工作的基本能力:,掌握信息,复习文献的能力；科学实验设计能力（创新思维能力）；科学实验操作能力；科学论文撰写发表能力；科学基金申请能力,13,寄语一年级研究生,尽快完成观念的转变处理好学习与研究的关系明确科学研究的目的注重科研能力的培养尽快进入角色,14,尽快进入“角色”,熟悉实验室PI的工作（查文献并浏览）(入学12月后在小组作汇报)熟悉实验室工作环境与实验操作(泡实验室;参与师兄/姐实验,第一学期起)永远做自己力所能及的事情参加 Lab meeting,Journal club,15,寄语一年级研究生受体学概述G-蛋白偶联受体简介G-蛋白偶联受体自身抗体与心血管结构和功能活动的关系,G蛋白偶联受体自身抗体与心血管疾病,16,受体(receptor)是细胞中直接地、特异地接受细胞间和细胞内化学信号的大分子。,受体的三个必备条件,信号转导,生理效应,受体的定义、分类、发展简史,受体学概述,17,受体,膜表面受体 细胞内受体,组成离子 G蛋白 酪氨酸激酶 通道的受体 偶联受体 偶联受体,化学门 控通道,受体学概述,18,19,受体的发展简史,受体概念的提出(1878年)药理学研究阶段由概念向实体的跃进阶段分子生物学研究阶段,受体学概述,20,受体的发展简史,受体概念的提出药理学研究阶段(1937年)由概念向实体的跃进阶段分子生物学研究阶段,受体学概述,21,药物作用的强度与所占据受体的数目成正比；,提出一个重要概念“受体占有学说”,1937年Clark研究乙酰胆碱对蛙心的作用时发现：,当占据了全部受体时，反应强度最大。,药物浓度,受体学概述,22,受体的发展简史,受体概念的提出药理学研究阶段由概念向实体的跃进阶段分子生物学研究阶段,受体学概述,23,由概念向实体的跃进阶段,有两项重大进展极大地推动了受体研究,1962 年 Jensen 和Jscobson将放射性同位素应用于受体研究1965年Sutherland发现了cAMP并创立了“第二信使”学说,受体学概述,24,将合成的高放射比度的氚标记雌二醇(3H-E)皮下或静脉注入大鼠,1962 年 Jensen 和Jscobson的研究,测量靶器官(子宫、阴道)的放射活性,测量非靶器官(肝、肾、肌肉)的放射活性,摄取量多、停留时间长、不转变,摄取量少、停留时间短、2小时后大部分已转变为雌三醇或雌酮,受体学概述,25,由概念向实体的跃进阶段,有两项重大进展极大地推动了受体研究,1962 年 Jensen 和Jscobson将放射性同位素应用于受体研究1965年Sutherland发现了cAMP并创立了“第二信使”学说,受体学概述,26,1957年 Sutherland 研究儿茶酚胺对肝糖原分解效应时发现：,Adr+肝组织切片磷酸化酶活性增强加速肝糖原分解,结论：催化肝糖原分解的磷酸化酶是限速酶,Adr能激活此酶,证实,实验 1,受体学概述,27,Adr+磷酸化酶孵育未加速肝糖原分解,Adr催化肝糖原分解是间接作用，需某种因子参与,实验 2,受体学概述,28,肝匀浆+Adr磷酸化酶被激活加速肝糖原分解,活性物质存在于肝匀浆,实验 3,受体学概述,29,实验 4,将肝匀浆离心,取上清+ATP+Mg 2+Adr磷酸化酶未被激活,活性物质存在于细胞膜,受体学概述,30,实验 5,取含细胞膜碎片的沉淀+ATP+Mg 2+Adr磷酸化酶被激活,受体学概述,31,Adr起作用时，只作用于肝细胞的膜表面经某种发生膜结构中的过程先在胞浆中生成某种小分子物质实现Adr分解糖原的作用,结果分析,受体学概述,32,取含细胞膜碎片的沉淀+Adr 离心，取上清+胞浆糖原分解增加,一种存在于匀浆可溶部分的、耐热的活性因子被发现,实验 6,受体学概述,33,这种耐热的小分子物质于1960年被证明是 cAMP，分子量329.2，对热、微酸、微碱煮沸半小时稳定Sutherland 于1965年提出“第二信使”学说Sutherland 于1971年获诺贝尔医学、生理学奖,受体学概述,34,The 1971 Nobel Prize,Earl W.Sutherland,Jr.Vanderbilt University Nashville,TN,USA,35,受体的发展简史,受体概念的提出药理学研究阶段由概念向实体的跃进阶段分子生物学研究阶段,受体学概述,36,受体的结合特性,高亲合力（high affinity）：配体与受体的解离常数Kd值通常在10-9 mol/L10-12 mol/L之间。特异性 可饱和性 可逆性 组织特异性 竞争性抑制,受体学概述,37,高亲合力 特异性(specificity):可饱和性 可逆性 组织特异性 竞争性抑制,受体只对一种特异的配体或同一类配体具有高度亲合力,可保证某种靶细胞在对一种信号起反应时,不受其它信号的干扰。,受体的结合特性,受体学概述,38,高亲合力 特异性 可饱和性（saturability）:相同靶细胞所含的特定受体数目相同，故配体与受体达到最大结合值后，不再随配体浓度增高而加大结合值。可逆性 组织特异性 竞争性抑制,受体的结合特性,受体学概述,39,高亲合力 特异性 可饱和性 可逆性（reversibility）:受体与配体的相互结合，是通过非共价键维系的，两者形成的是络合物而不是化合物，故具有可逆性。组织特异性 竞争性抑制,受体的结合特性,受体学概述,40,高亲合力 特异性 可饱和性 可逆性 组织特异性（target localization）:受体以不同密度存在于靶细胞或靶组织的不同区域，所以不同靶细胞或靶组织所含的特定受体数目也不相同。竞争性抑制,靶细胞A,靶细胞B,受体的结合特性,受体学概述,41,高亲合力 特异性 可饱和性 可逆性 组织特异性 竞争性抑制：与配体结构相似的化合物，也能通过与受体结合，使受体与配体结合的位点减少或消失，这种现象称为竞争性抑制。,受体的结合特性,受体学概述,42,受体研究的基本方法,受体的研究方法概述受体的放射配体结合测定受体功能分析方法,受体学概述,43,受体研究的基本方法-受体基本特征的研究,受体在各个水平的分布；受体的基本结合参数：Bmax值:受体结合的最大容量；Kd值：受体的平衡解离常数；配体的种类及其性质；受体型及亚型的确定。,受体学概述,44,利用受体和配体结合的高度特异性以及放射性核素测量的高灵敏度的特点,用放射性核素标记配体(L*),在一定条件下使其与受体结合,形成受体-配体复合物(RL*),通过测量RL*的放射活性,达到了解受体结合活性的目的。,1.基本原理,受体研究的基本方法-放射配体结合分析,受体学概述,45,受体研究的基本方法-放射配体结合分析,B,F,F,B,受体学概述,46,L*不仅与受体呈特异性结合,还与组织蛋白(P)呈非特异结合,形成PL*.,2.技术关键-非特异结合的干扰,R+P+L*,RL*+PL*,能否降低PL*是放射配体结合测定的关键,受体研究的基本方法-放射配体结合分析,47,尽量降低标记配体的浓度(高亲和力)使用高放射比度的标记配体(高灵敏度)提高标记配体的放化纯度(特异性)在加入L*的同时,再加入500-1000倍的L(可饱和性),3.降低非特异结合的关键,受体研究的基本方法-放射配体结合分析,受体学概述,48,样品+L*(系列浓度)样品+L*+L(500-1000倍)将B与F分离 将B与F分离 测定放射活性 测定放射活性 计算特异结合的放射活性测定样品的蛋白浓度,样品的制备,4.实验步骤,受体学概述,49,5.Scatchard作图-制备饱和曲线,温育,L*,组织或细胞,受体研究的基本方法-放射配体结合分析,50,投入的放射性配体量（pmol/L）,结合的放射性配体量,(fmol/mg Pro),Non-specific,Specific,Total,5.Scatchard作图-制备饱和曲线,受体学概述,51,6.竞争抑制实验,则L与L*竞争性地与R结合，最后形成的放射性复合物的多少，将取决于两种配体（L和L*）的量以及它们各自与该受体的亲合力，这种反应称为 竞争性结合反应。,如果在R和L*的反应体系中，加入另一种也能与该受体起特异性结合反应、但不带标记的L，,受体研究的基本方法-放射配体结合分析,受体学概述,52,用一种浓度的L*及14-16种浓度的L 与组织或细胞在一定条件下温育分离已与受体结合的放射配体放射性测定L的浓度越大，RL*的量越少竞争抑制曲线,6.竞争抑制实验,受体学概述,53,100%,L浓度,50%,L*相等,6.竞争抑制实验,受体学概述,54,受体研究的基本方法-受体功能分析方法,受体的两个基本作用,特异结合,功 能,受体学概述,55,受体研究的基本方法-受体功能分析方法,要说明所测得的特异结合是受体，就必须证明它是有功能的,受体学概述,56,受体研究的基本方法-受体功能分析方法,了解激动剂对所研究的细胞有无作用？有何作用？做激动剂的量效曲线，通过对EC50 和Kd值的比较，对所测定的部位是否介导了这种效应，大体上有个估计。观察竞争性拮抗剂对效应的影响，如果能阻断激动剂所产生的效应，则可判定这种效应是由这种特异结合部位受体，所介导的。,受体学概述,57,寄语一年级研究生受体学概述G-蛋白偶联受体简介G-蛋白偶联受体自身抗体与心血管结构和功能活动的关系,G蛋白偶联受体自身抗体与心血管疾病,58,G-蛋白偶联受体,参与G蛋白耦联受体跨膜信号转导的主要信号分子G-蛋白偶联受体的结构G-蛋白耦联受体介导的跨膜信号转导,59,60,（一）参与G蛋白耦联受体跨膜信号转导的信号分子,1.G蛋白耦联受体G(protein-linked/coupled receptor),也称促代谢型受体（metabotropic receptor）或 7次跨膜受体（7-transmembrane receptor）,61,2.G蛋白,鸟苷酸结合蛋白（guanine nucleotide-binding protein），简称G蛋白（G protein），是耦联膜受体与下游效应器蛋白（酶或离子通道）的膜蛋白。,（一）参与G蛋白耦联受体跨膜信号转导的信号分子,62,（一）参与G蛋白耦联受体跨膜信号转导的信号分子,3.G蛋白效应器（G protein effector）,腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase,AC)磷脂酶C(phospholipase C,PLC)磷酸酶A2(phospholipase A2,PLA2)鸟苷酸环化酶(guanylyl cyclase,GC)cGMP磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)等,63,（一）参与G蛋白耦联受体跨膜信号转导的信号分子,4.第二信使（second messenger）,环一磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)二酰甘油(diacylglycerol,DG)环一磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)Ca2+,64,G-蛋白偶联受体,参与G蛋白耦联受体跨膜信号转导的主要信号分子G-蛋白偶联受体的结构G-蛋白耦联受体介导的跨膜信号转导,65,66,G-蛋白偶联受体,参与G蛋白耦联受体跨膜信号转导的主要信号分子G-蛋白偶联受体的结构G-蛋白耦联受体介导的跨膜信号转导,67,G-蛋白偶联受体介导的跨膜信息转导,G-蛋白的发现G-蛋白的结构特点和分类G-蛋白的作用机制G-蛋白耦联受体信号转导的主要途径,68,1965年Sutherland 提出第二 信使学说 1971年，Rodbell发现胰高血糖素激活大鼠cAMP需要GTP存在，提出受体与效应器之间应存在一个转换器1977年，Ross和Gilman证实此转换器为G蛋白,G-蛋白的发现,69,认为：一些激素可激活C膜的AC，生成第二信使 物质cAMP，并以后者调节C内的代谢。H+ACcAMP 磷酸化酶 糖原分解,1965年Sutherland 提出第二 信使学说,推测：受体与AC的关系受体与AC直接偶联；或受体与AC的关系类似酶的调节亚单位与催化亚单位的关系。,70,1971年Rodbell的研究发现,71,细胞外,细胞内,信号A,信号B,识别器,传感器,放大器,受体,细胞内信号第二信使,Martin Rodbell 的信号传导设想,细胞膜,GTP,GDP,72,1981、1983年Gilman的研究,73,1981、1983年Gilman的研究,74,1981、1983年Gilman的研究,?!,75,1981、1983年Gilman的研究,灭活了AC的细胞匀浆中，含有能激活AC的物质,76,77,for their discovery of G-proteins and the role of these proteins in signal transduction in cells,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1994,Alfred G.GilmanUniversity of Texas Southwestern Medical Center at Dallas,Dallas,TX,USA,Martin Rodbell National Institute of Environmental Health Sciences,Research Triangle Park,NC,USA,78,G-蛋白偶联受体介导的跨膜信息转导,G-蛋白的发现G-蛋白的结构特点和分类G-蛋白的作用机制G-蛋白耦联受体信号转导的主要途径,79,G蛋白是一个异三聚体的蛋白质，由、三个亚基组成。其中亚基具有GTPase活性。G蛋白是一个有很多成员的蛋白家族，各种G蛋白差异主要在亚基上。至2001年，已确定23种G，5种G和10种G，可以有上千种组合。,80,81,82,83,84,G-蛋白偶联受体介导的跨膜信息转导,G-蛋白的发现G-蛋白的结构特点和分类G-蛋白的作用机制G-蛋白耦联受体信号转导的主要途径,85,86,G-蛋白偶联受体介导的跨膜信息转导,G-蛋白的发现G-蛋白的结构特点和分类G-蛋白的作用机制G-蛋白耦联受体信号转导的主要途径,87,此类受体的信息转导可归纳为,88,1.受体-G蛋白-AC途径,1个,至少100个,G蛋白耦联受体信号转导的主要途径,89,90,91,92,二磷酸磷脂酰肌醇,G蛋白耦联受体信号转导的主要途径,2.受体-G蛋白-PLC途径,93,寄语一年级研究生受体学概述G-蛋白偶联受体简介G-蛋白偶联受体自身抗体与心血管结构和功能活动的关系,G蛋白偶联受体自身抗体与心血管疾病,94,循环生理学复习题,如何进行受体特性的研究?试举例说明.如何证明抗受体抗体对相应受体的作用？,95,如何进行受体特性的研究?试举例说明.,了解所研究的受体密度在所研究器官或细胞的分布；阐明该受体激动时的表现及信号转导通路；研究该受体的临床意义：,第一步：引言,受体结合特性的研究（Bmax,kd）；受体功能特性的研究；,第二步：研究内容与方法,第三步：研究目的,96,如何证明抗受体抗体对相应受体的作用？,抗体对受体结合特性的影响抗体对受体功能的影响抗体对受体下游信号转导途径中，关键信号分子的影响如何证实这些影响？,