《平面色谱技术》PPT课件.ppt

5.平板色谱一般分离过程,将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。纸层析和薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用。,比移值（R)：溶质移动距离与流动相移动距离之比,1）纸色谱,载体：滤纸（纤维素），可吸附22%水，其中 6%与纤维素上的羟基结合（通过氢键和分子 之间的偶极作用）形成固定相,纸色谱属于分配色谱-正相和反相分配纸色谱,2)薄层色谱,薄层 分离机制 主要应用范围氧化铝板 吸附 脂肪和芳香化合物、生物 硅胶板 吸附 碱、甾类、萜类改性硅胶 C2,C8,C18RP 正相、反相 非极性物质、极性物质CN板 正相、反相 农药、酚类、甾类NH2板 正相、反相、核苷酸、农药、酚类、甾类、阴离子交换 维生素类、嘌呤衍生物纤维素 分配 氨基酸、梭酸乙酰纤维素 正相、反相 蒽醌类、抗氧化剂离子交换剂 阴、阳离子交换 氨基酸、梭酸、氨基糖、肽聚酰胺 分配 黄酮类、酚类葡聚糖凝胶 凝胶过滤 蛋白质、核苷酸,2.薄层色谱操作技术,1)薄层板,(1)载体：硅胶：表面带有硅醇基，pH=4.5，经150活化脱水 后，46个硅醇基/nm2,(2)薄层参数：厚度：普通薄层 高效薄层 制备薄层 0.25mm 0.2mm 0.52mm 活度：吸附剂的吸附能力可用活度表示,它随含水量的增加而减弱,硅胶、氧化铝活度、含水量与吸附力的关系,不同温度下硅胶表面硅醇基吸附水分子层的损失情况,(3)粘合剂与添加剂,粘合剂a.煅石膏（CaSO42H2O)：120140烘烤24h,过200目筛，密闭备用。b.羧甲基纤维素钠（-a)：0.21.0%,添加剂a.荧光指示剂 ZnSO4:Mn 254nm ZnSCdS:Ag 366nmb.酸、碱或缓冲液c.硝酸银溶液：饱合化合物 炔烃 反式烯烃 顺式烯烃,(4)薄层的制备方法 手工制板 a.软板 b.硬板(含粘合剂),匀浆,涂布,凉干,活化,预制板：玻璃板、塑料板、铝箔板 a.普通薄层预制板-硅胶、氧化铝、纤维素、硅藻土、聚酰胺、离子交换纤维素、烷基键合硅胶反相板 b.高效薄层预制板-氨基、氰基键合硅胶板、手性预制板、聚酰胺、混合预制板（如：氧化铝-纤维素、纤维素-硅胶、硅藻土-硅胶等）,(5)薄层板的活化 吸附剂的表面及其孔隙的表面存在许多活性点，活性点的强度和数目较大时，吸附剂的活度就高，吸附剂的保留能力也较高，被保留物质R值就小。活化：105120干燥 0.51h 级 活度的标定：a.氧化铝薄层活度的标定 染料溶液的配制：称取偶氮苯30mg和对-甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、对-氨基偶氮苯各20mg溶于四氯化碳50ml中，摇匀备用。标定方法：取上述溶液20l点于待测板上，用四氯化碳展开，测量五种染料的R，由下表中确定薄板的花度级别。,氧化铝薄层的活度级别,b.薄层活度的标定 染料溶液的配制：称取对-二甲氨基偶氮苯、靛酚蓝、苏丹红（苏丹）各20mg溶于1ml氯仿中，摇匀备用。标定方法：取上述溶液点于待测板上，用正己烷-乙酸乙酯（9：1）展开，三种染料能分开，对-二甲氨基偶氮苯在前缘，靛酚蓝在其次、苏丹红走在最后，这样的硅胶活度与前述级氧化铝的活度相当。,（6）薄层板的预处理 常用方法：用氯仿-甲醇(1:1)或所用展开剂先展开一次空白薄层板（展距要大一些），在110干燥0.51h，干燥器中保存备用。除有特殊规定外，预制板在使用时不需任何预处理。,（7）烧结薄层板和棒状薄层 机械强度高、热稳定性好、耐酸并可反复使用,2）点样：（1）样品溶液的制备 纯品的溶解 样品的提取与净化 a.溶剂提取法 b.液液萃取法 c.液固萃取法-亲脂型和亲水型固体萃取剂,溶剂的选择 a.溶剂对溶质的溶解度相对较小，否则会出现点样环形色谱效应；b.溶剂的粘度不宜太高，以便于点样；c.溶剂的沸点要适中。,(2)点样 样品浓度 0.011.00%点样体积 经典薄层 15 l 高效薄层 0.10.5 l 点样过多会造成原点“超载”，展开剂产生“绕行”现象使斑点拖尾或重叠，严重影响分离。点样直径 经典薄层 5mm(一般3mm)高效薄层 12mm 点样间距 经典薄层 12cm 高效薄层 0.5cm,点样方法 a.点状点样 b.带状点样 c.自动点样 d.接触点样,接触点样示意图,3）展开：（1）展开方式 线性展开 a.上行展开 b.下行展开 c.双向展开 d.近水平展开 环型展开 展距短、展速快、节约展开剂、分离效率高，适用于R较小的组分的分离。(Rc)2=R,反圆心式展开 展速快、可提高R值较大组分的检测灵敏度和定量准确性。多次展开 a.单向多次展开 nR=1-(1-R)n 一般二次展开即可,能得到最佳的分离,但还不能使斑点十分浓集。b.增量多次展开 增量多次展开能提供比一般薄层色谱好得多的分离度，在短时间内得到较多次展开，有利于斑点的浓集及R值较小的组分的分离。,c.阶式展开（分级展开）使用两种或两种以上极性不同的展开剂分别展开几次，可以将极性相差很大的组分在一块薄层板上分离。用乙醚-环己烷-甲醇（5：3：0.5）、乙醚-环己烷-甲醇（5：3：0.5）、甲苯-氯仿-甲醇-二乙胺（7：2：1：0.3）展开三次，在一块薄层板上实现了11种异喹啉生物碱的分离。,在常规色谱中，仅在展开时出现一次斑点浓集。如重复展开n次，则最后斑点宽度降低到:(1-R)n 起始宽度，但实际上没有(1-R)n 那么明显，主要是展开时又扩散增宽，所以多次展开的优点不是在斑点的宽度上，而是增加相邻斑点的距离，并经过一个最大值后再随着继续展开而降低。,对R 值低的斑点这种浓集更有效，这意味着对极性较大组分的分离效率及灵敏度的提高。,连续展开 不增加薄层板长度而使展距加长，使R值较小的组分移动较大的距离从而得到较好的分离。a.Regis短床展开室,连续展开示意图,b.蒸发展开 当展开剂前沿推进到某一位置时，流入薄层的展开剂量恰好全部蒸发掉，此时处于稳定态，溶剂必然成负速度梯度，因此蒸发展开的分离效果比普通展开方式为高，有利于R值小于0.3的组分的分离。,蒸发展开示意图,(2)影响薄层展开的因素 相对湿度 a.预活化的薄层板可迅速吸附空气中的水蒸气，数分钟内可达平衡；b.溶质和溶剂极性的增加，展开时最佳相对湿度的范围也相应增大。c.控制相对湿度的方法:硫酸溶液法、无机盐溶液法 溶剂蒸气的影响 a.展开室饱和 b.预吸附 c.吸附饱和 d.毛细管饱和,温度的影响 温度对分配色谱影响较大，对吸附色谱影响较小。展距的影响 展距增加一倍，分离度为原来的21/2倍。,（3）展开剂的选择,分子间的作用 a.色散力 b.偶极作用 c.氢键作用 d.介电作用,色散力很弱,无选择性,对层析无关重要对非电解质溶剂主要研究它们的偶极作用和氢键作用介电作用只对溶解离子化合物的样品溶剂有重要意义,展开剂的极性和强度 a.极性参数P 混合溶剂的P值 P=APA+BPB PA、PB分别代表溶剂A和B的极性参数，A和B分别代表它们在混合溶剂中的体积分数。A/B两种溶剂组成的展开剂，当用溶剂C去替换溶剂B并保持展开剂极性不变，则C可按下式计算：C=B（PB/PA）展开剂强度越强,样品组分k值越小，R值越大;反之亦然。,b.强度参数（：吸附层析，S：反相层析）溶剂在单位表面积的标定活度的吸附剂上的吸附能。它是通过实验测定 的，以丙烷的为零，其它溶剂的与丙烷比较而求得的相对值。,在硅胶上与P的关系曲线,Synder溶剂选择性分组,溶剂分类,溶剂选择性三角形,展开剂的选择 原则：先找出一种极性或强度能使组分的k 值在110（最好在0.55,或R值在0.650.17)之间，保持这个强度不变，改变展开剂的选择性直到使组分有合适的分离度。a.选择展开剂的方法 a)三角形法 b)点滴试验法,b.二元展开剂的极性和强度的选择 二元展开剂由一种强度较大的溶剂（极性调节剂）和一种强度近于零的溶剂（底剂）按一定比例混合而成。,乙醚-正己烷（50：50）P=乙醚P乙醚+正己烷P正己烷=0.52.8+0.50=1.4,在乙醚-正己烷（50：50）中，分别用氯仿、二氯甲烷替代乙醚，其体积比为：氯仿=0.52.8/4.1=0.34 二氯甲烷=0.52.8/3.1=0.45 氯仿：正己烷（34：66）二氯甲烷：正己烷（45：55）为了使选择性的差别达到最大，应该从靠近三角形顶部的组中选择强度较强的溶剂。,c.二元展开剂的选择性 二元展开剂选择性的改变，主要是通过其中强度较强溶剂的组别的替换来实现的。,d.其它因素 a)拖尾抑制剂 b)降低粘度和促溶作用 氯仿-甲醇-水、正丁醇-冰醋酸-水,吸附层析法中的几条规则：增大则R值增大，但选择性变小；减小则R值减小，但选择性增大。二元展开剂中，当强度较强的溶剂所占体积最大或最小时选择性最大。当展开剂的组成改变时，如果能引起溶剂分子和溶质分子间的氢键作用的改变，则会产生最大的选择性。如果用无水展开剂时组分斑点拖尾，则可选用去活性的吸附剂。,4）定位和定性,（1）光谱检出法 紫外 0.5g 荧光 0.01ng（2）蒸气检出法（3）试剂显色法 显色方法 a.喷雾显色b.浸渍显色c.超压衍生化d.展层-显色法 显色试剂,a.通用显色剂 a)硫酸 组成：硫酸-水（1:1），硫酸-甲醇或乙醇（1:1），1.5M硫酸与0.51.5M硫酸铵。方法：喷后110烤15min,不同有机物显不同颜 色。b)0.5%碘的氯仿溶液 c)中性0.05%高锰酸钾溶液 易还原化合物在淡红背景下显黄斑。d)5%磷钼酸乙醇溶液方法：喷后120烘烤，还原化合物显蓝斑，再用氨气熏，则背景变无色。,b.专属显色剂,（4）定性 斑点的R值斑点的显色特性 斑点的原位光谱扫描a.薄层色谱-紫外可见光谱扫描b.薄曾色谱-三维光谱扫描与其它分析技术的联用 a.与其它色谱法：GC、HPLCb.与电化学法联用：阳极伏安法、脉冲极谱法、库仑滴定法c.与光谱法联用：原子吸收、拉曼光谱、IR、MS、NMR（）定量,平板色谱简单、方便、及操作费用低，可以在一块层析板上同时展开多个试样及将多条滤纸同时展开。采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开，即按一般方法展开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步改善分离效果。试样一般不需要经过预处理即可分离。,.平板色谱特点及应用,缺点：分离效率较低，不适用挥发性试样分离。定性定量不便。应用：平板色谱法在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离分析中经常被使用。也可以用于无机离子的分离。还经常作为液相色谱的一种预试方法。,合成药物的分析方面的应用药物的定性检鉴别纯度检查合成药制剂的含量测定稳定性考查药物代谢研究合成工艺的监控及反应机制的研究,谢谢！,各组分在薄板上的位置常用比移值（Rf）来表示。A，B为样品溶液点样的位置，如图1所示：,1、比移值（Rf）,A物质的Rf=;B物质的Rf=;所以Rf值与K之间关系可用下式表示：Rf=1/1+K（Vs/Vm）,在一定色谱条件下，Rf值为常数，其值在01之间，若某组分Rf=0，表示它不随展开剂移动，吸附剂对它的吸附力很强，留在原点不动。若Rf=1，表示吸附剂对它基本不吸附，随着展开剂到达溶剂前沿，K=0。Rf值越小，表示该组分K越大，极性越大。根据物质的化学结构不同，极性不同，在同一薄板上展开，我们能预测它们的Rf值大小。,