实验八 聚炳烯凝胶电泳.ppt
,血清蛋白的分离-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,一、实验目的,学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术,二.基本原理,(一)电泳 电泳:带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极移动的现象.,(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳,用丙烯酰胺(Acr)单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合成的多孔介质.以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。,1.聚丙烯酰胺凝胶有下列特性,(1)凝胶有弹性，机械性能好；几乎无吸附和电渗作用，样品分离重复性好；(2)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度较高。(3)凝胶孔径可调节，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(4)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。,2.凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关,3 凝胶聚合催化体系,（1）光催化：核黄素,（2）化学催化：AP-TEMED 催化体系,Bis将单体长链间连成网状结构,化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响：催化剂和加速剂的浓度 pH 碱性条件 温度 分子氧 杂质,4.聚丙烯酰胺凝胶种类(1)连续系统与不连续系统两大类,不连续系统:是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。,(2)不连续体系:电极缓冲液、浓缩胶及分离胶,浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH 6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH 8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH 8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。,1)样品浓缩效应 A.凝胶孔径不连续性 B.缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 C.电位梯度的不连续性 2)分子筛效应 3)电荷效应,(3)不连续体系凝胶对蛋白的分离作用,三.实验器材,1、电泳仪,电泳槽及其附件2、培养皿3、摇床4、烧杯5、移液管6、微量进样器7、针管,电 泳 装 置,电泳仪：提供直流电在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移,垂直平板电泳槽,每组（3人）做一板胶，前后可安置两副板，两组共用一套电泳装置。,四.实验试剂,人血清；分离胶缓冲液：Tris-HCl缓冲液 PH8.9；浓缩胶缓冲液:Tris-HCl缓冲液 PH6.7；分离胶贮液:Acr 28.0g,Bis 0.735g,无离子水溶解定容至100ml；浓缩胶贮液:Acr10.0g,Bis2.5g,无离子水溶解定容至100ml；过硫酸铵溶液（AP）电泳缓冲液:Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3；固定染色液脱色液,(一)垂直平板电泳槽的安装(二)凝胶的制备(三)加样(四)电泳(五)固定和染色(六)脱色,五.操作步骤,五.操作步骤,(一).垂直平板电泳槽的安装,注意短玻璃板是向内侧的。,要将玻板底边平齐地压紧在红色橡胶条上，否则容易漏胶。,(二).凝胶的制备,1 分离胶的制备(7%)配8 mL(按如下顺序加入）,分离胶缓冲液 1 mL分离胶贮液 2 mL去离子水 4 mLTEMED 2 uL过硫酸胺（AP)1 mL,将上述试剂迅速混匀后，用滴管沿壁迅速加样至2/3处，再取大约3 mL的水加在上面直至凝胶凝固为止。,加入此物后请迅速混匀加样，否则易凝固无法加样,凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.,水封的目的是为了使分离胶上缘平直，并排除气泡,2.凝聚后倒出上层的高纯水，可用滤纸在边缘吸水。,3.浓缩胶的制备(2.5%)配 4 mL(按如下顺序加入）,浓缩胶缓冲液 0.5 mL浓缩胶贮液 1 mL去离子水 2 mL过硫酸胺（AP)0.5 mL,迅速混匀,用胶头滴管沿壁连续平稳加样到分离胶上面,直至上边缘,迅速插入加样梳,室温静置一段时间.加样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平，注意梳子的朝向，平的一面贴长玻板.,凝胶凝聚后，垂直小心拔出加样梳，用窄条滤纸吸在玻板边缘吸去多余的液体。,(三).进 样,除去底板，将制胶装置放在电泳槽内，加入稀释10倍的Tris甘氨酸电极缓冲液（注意：加缓冲液先从内槽加入，上面没过短玻璃板，外槽液面没过最下一个螺丝处,加样前要使凝胶凹形样品槽内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.（用针筒将凹洞中的气泡抽出）,用微量进样器取已经混合好的样品 15l，在距凝胶凹形槽底三分之一处缓缓进样,每人加2个样，两边各留2 孔不加样，避免边缘效应。加样时不可过低,以防刺破胶体,(三).进 样,(四).电 泳,将电泳仪的正极负极与电泳槽连接（方向切勿接错），打开电泳仪开关，开始时将电压调至150V，待样品进入分离胶时，将电压调至250V。当蓝色染料迁移至距离凝胶下端2cm时，将电流调回到零，关闭电源。,电泳结束后，卸下胶框，用凝胶铲小心撬开短玻璃板，（不要撬两边耳朵处，易断裂）在胶板一端切除一角作为标记，用缓冲液冲洗胶板，将其移至大培养皿中染色。剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.,(五).固定和染色,将凝胶放入固定染色液中，使染色液刚好没过胶板，放到摇床上，缓慢摇动，染色7 min。(注意染色液要用漏斗回收）,(六).脱 色,放置摇床上，用脱色液漂洗数次，直至背景蓝色褪去。,六.实 验 结 果,可在培养皿下衬一白纸，便于观察，用手机拍下凝胶图，打印出来附在实验报告后。,1、Acr和Bis为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作应戴手套。2、玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与 玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；拨胶时凝胶板易断 裂，为防止此现象，所用器材均应严格的清洗。3、安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏，但亦不可太用力 旋，易将玻板边缘压破。4、制备浓缩胶时，注意梳齿边缘不能有气泡,胶凝聚后，注意拔梳 子要垂直小心拔出。5、电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方 向泳动。,注 意 事 项,Thank you for your attention,
