《工业微生物》PPT课件.ppt

,第四章 病 毒,本章内容,第一节 概述第二节 病毒的形态结构与化学组成第三节 噬菌体第四节 真核细胞病毒第五节 亚病毒第六节 病毒与发酵工业,第一节 概述,一、病毒的发现和研究历史二、病毒的定义与特点三、病毒的分类四、病毒的培养与纯化,病毒和我们的关系,“Virus”，它是由拉丁文中“virus”一词演化而来，即“有毒的物质”,第一节 概 述,一、病毒的发现和研究历史,1886年，A.Mayer 发现具有传染性的烟草花叶病；,1892年，D.Ivanovsky烟草花叶病病原体能通过细菌滤器：一种能通过细菌滤器的“细菌毒素”或“极小细菌”,1898年，M W Beijerinck对烟草花叶病病原体的研究结果：,能通过细菌滤器；可被乙醇沉淀而不失去其感染性，能在琼脂凝胶中扩散；用培养细菌的方法不能被培养出来，推测只能在植物活细胞中生活,比细菌小的具有传染性的活的流质（contagium vivum fluidum）,1884年Chamberland发明细菌滤器,1900年前后，包括口蹄疫（foot and mouth disease）在内的多种动植物疾病病原体的滤过性特性被证明。,F W Twort（1915年）、F dHerelle（1917年），分别发现细菌（Shigella dysenteriae）病毒-噬菌体,1935年，W M Stanley首次提纯并结晶了烟草花叶病毒；Bawden等证明烟草花叶病毒的本质为核蛋白；1940年，Kausche首先用电镜观察到烟草花叶病毒颗粒.,1952年，Hershey和Chase利用同位素证实噬菌体的遗传物质是DNA，将人类带入病毒的分子生物学阶段。,极大地丰富了现代生物学（微生物学、分子生物学、分子遗传学）的理论与技术；,病毒学（virulogy）：,研究病毒（virus）的本质及其与宿主的相互作用的科学，是微生物学的重要分支学科。,有效地控制和消灭人及有益生物的病毒病害；利用病毒对有害生物、特别是害虫进行生物防治；发展以基因工程为中心的生物高新技术产业；,非细胞生物,至少含核酸和蛋白质二种组分,亚病毒,真病毒,类病毒,拟病毒,朊病毒,只含有不具侵染性的RNA组分,只含蛋白质组分,只含具侵染性的RNA组分,本章主要介绍真病毒,二、病毒的定义与特点,病毒：是一种结构简单，能够自我复制并具有侵染性的独特非细胞生物体。现代病毒学家把病毒这类非细胞生物分成真病毒（Euvirus，简称病毒）和亚病毒（Subvirus）两大类：,病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征；既具有细胞外的感染性颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。,病毒分两个阶段（以两种形式）存在：胞外阶段：“毒粒”形式存在，可抵抗几乎所有酶的侵袭，但不能独立于活细胞增殖；胞内阶段：主要以正在复制的核酸形式存在，诱导宿主 细胞合成病毒组分；,毒粒：完整的病毒粒子（virion），由蛋白外壳包裹一个或多个DNA或RNA分子构成,特性,1）个体微小，在电子显微镜下才能看见；,2）不具有细胞结构，其主要成分为核酸和蛋白质，故称为“分子生物”；,3）一种病毒只含有DNA或RNA一种类型的核酸；,4）绝对的细胞内寄生，在细胞外不能增殖：既无产能酶系，也无蛋白质和核酸合成酶系，只能利用宿主活细胞内现成的代谢系统合成自身的核酸和蛋白质；,5）没有个体生长，不能进行细胞分裂，以核酸复制和蛋白质合成、然后装配的过程实现其大量繁殖；,7）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。,6）在离体条件下，以无生命的生物大分子状态存在，并保持其侵染性；,三、病毒的分类,病毒几乎可以感染所有的细胞生物，并具有宿主特异性。,人们习惯根据其宿主种类将病毒分类：,噬菌体（phage）,真菌病毒（fungi viruses）,植物病毒（plant viruses）,动物病毒（animal viruses）,国际病毒分类委员会（International Committee for Taxonomy of Viruses,ICTV）提出了分类依据和建立了分类系统。,分类依据,核酸的特征、壳体的对称形式、有无包膜、宿主的种类、引起的疾病种类、复制和释放方式等。,命名规则,1996年国际病毒分类委员会提出38条新的病毒命名规则，病毒分类系统依次用目、科、属、种分类等级。,1）噬菌体的培养,1、病毒的培养,(二元培养物法),四、病毒的培养和纯化,噬菌斑（plaque）：,将少量噬菌体与大量宿主细胞混合后，在合适条件下培养一定时间后，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上，出现一个个肉眼可见的透明小圆斑。（“负菌落”）,设0.10mL稀释度为10-6的病毒悬液可产生75个噬菌斑，则样品的噬菌斑形成单位为：PFU/mL=（75 PFU/0.10 mL）（106）=7.5 108,2）动物病毒的培养,动物病毒,实验动物,鸡胚,多种细胞培养,在尿囊膜上形成一些白色的庖痘（感染造成局部组织病损）,感染,若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区域，即蚀斑（plaque）或称空斑。,包涵体（inclusion body）：,在某些感染病毒的宿主细胞质或细胞核内，出现光学显微镜下可见的大小、形状和数量不等的小体。,多数位于细胞质内，如：痘病毒、狂犬病毒少数位于细胞核内，如：疱疹病毒和腮腺炎病毒有的既可在细胞质内，又可在细胞核内，如：麻疹病毒,包含体可以是病毒粒子的聚集体，如昆虫核型多角体病毒和质型多角体病毒的包含体；也可以是病毒结构蛋白与感染有关蛋白质等病毒组分的聚集体,多角体：,核型多角体病毒（NPV）：是我国自主研究并应用于农业实践的第一个病毒杀虫剂。,昆虫细胞内形成多角形包涵体，可作为病毒杀虫剂。,植物病毒,敏感植物叶片,被感染部位的细胞快速死亡而形成局部坏死斑，或称枯斑,即便没出现坏死斑，被感染的植物仍会表现一定的病症，如色素形成和叶子形状改变等。,3）植物病毒的培养,（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等）,2、病毒纯化,标准：纯化的病毒制备物应保持其感染性，纯化的病毒制备物的理化性质应具有均一性,方法：主要化学组成为蛋白质，采用蛋白质提纯方法,具有一定的大小、形状和密度，采用离心,差速离心、梯度离心（超速离心）,一、病毒的形态结构,1、病毒的形状和大小,个体小（测量单位nm），必需在电镜下观察；不同病毒的毒粒大小差别很大（10400nm）,（1）大小,痘病毒：300450nm 170260nm（最大）双粒病毒：直径 1820nm（最小）,第二节 病毒的形态结构与化学组成,（2）病毒的形态,弹状（狂犬病毒）、砖块状（痘病毒）、丝状（大肠杆菌f1、fd、M13噬菌体）等,多形性（流感病毒，新分离的毒株呈丝状，在细胞内稳定传代后转变为拟球状）。,基本形态：,球形或拟球形（大多数动物病毒）；,杆状（植物病毒和昆虫病毒）；,蝌蚪状（大肠杆菌T偶数噬菌体）,其他形态：,各种毒粒的大小、形态差异很大,蝌蚪状（大肠杆菌T偶数噬菌体）,砖块状（痘病毒）,丝状（大肠杆菌M13）,球状(脊髓灰质炎病毒),衣原体,大肠杆菌,红细胞,杆状(TMV),基本构造：核衣壳(nucleocapsid),非基本构造,2.病毒的基本结构,核心（core）：DNA或RNA,衣壳（capsid）：蛋白质,包膜(envelope)：脂蛋白或类脂、糖蛋白,刺突(spike)：糖蛋白,核心,衣壳,包膜,刺突,衣壳粒（capsomere或capsomer）：是组成衣壳的蛋白质亚单位,3.几种典型病毒衣壳的结构,螺旋对称衣壳病毒：烟草花叶病毒,病毒可以根据衣壳中衣壳粒的排列方式将其分为3种：,二十面体对称衣壳病毒：腺病毒,复合对称衣壳病毒：T4噬菌体,壳体外形如中空的蛋白质圆管，呈坚硬或柔韧状。由2130个相同的蛋白质亚基（158个氨基酸）以逆时针方向螺旋状排列，形成一个长300nm，内径4nm，外径15nm的刚直中空柱。ssRNA盘绕在壳体内面由亚基形成的沟内，与蛋白质亚基通过弱键结合。,螺旋对称壳体病毒,代表：TMV,并非所有螺旋对称衣壳都像TMV衣壳一样是刚直的，流感病毒的RNA就包围在薄的、柔软易弯曲的螺旋壳体内，其衣壳折叠在一起，外有包膜。,流感病毒,二十面体对称壳体病毒,衣壳有20个等边三角形面，12个顶角。包括12个五邻体（分布在12个顶角上的衣壳粒）和240个六邻体（分布在棱上和面上的非顶角衣壳粒）。核心为线状双链DNA(dsDNA)，核酸分子以高度卷曲的状态存在于衣壳内。,代表：腺病毒,五邻体,六邻体,二十面体衣壳在形成时通常是由五边形衣壳粒（五邻体）和六边形衣壳粒（六邻体）组成的,（参见P74）,其壳体由头部和尾部组成。通常头部呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。线状dsDNA折叠盘绕于头部的核心。,复合对称衣壳病毒,代表：大肠杆菌的T偶数噬菌体,头,尾髓,颈环,尾鞘,尾丝,刺突,基板,1、病毒的核酸,病毒基因组大小差别很大 最小的基因组（MS2病毒，QB病毒）只有1 106 Da，仅够编码34种蛋白质，这些病毒利用重叠基因来节省空间。最大的基因组（T偶数噬菌体，疱疹病毒，痘病毒）达1.6 108 Da，可编码100多种蛋白质。,二、病毒的化学组成,单链DNA（ss DNA）；双链DNA（ds DNA）；单链RNA（ss RNA）；双链RNA（ds RNA）,4种类型,动物病毒这4种类型都有；植物病毒通常含有ssRNA；噬菌体通常为ds DNA，但也有一些噬菌体为ss DNA或ss RNA。,(1)DNA病毒,dsDNA：大多数DNA病毒以dsDNA作为遗传物质。许多病毒dsDNA经过修饰,呈线性，少数为环状dsDNA。,特殊的碱基：除常见核苷酸外，许多病毒具有特殊的碱基，如，大肠杆菌T偶数噬菌体以5-羟甲基胞嘧啶代替胞嘧啶。,噬菌体的线性dsDNA:有由12个氨基酸组成的粘性末端，粘性末端配对可使DNA环化。,ssDNA:少数，如X174、M13噬菌体等，有线性和单链闭合环状DNA两种。,(2)RNA病毒,多数RNA病毒以ssRNA作为它们的遗传物质。正链或阳性链：RNA碱基序列与病毒mRNA相同，指导蛋白质合成。如：脊髓灰质炎病毒，等 负链或阴性链：病毒RNA基因组与病毒mRNA互补。如：狂犬病毒，等。,片段基因组：许多RNA病毒基因组被分为独立的片断，每个片段编码一种蛋白。有的病毒基因组可以分为10到12个片段（如呼肠病毒），通常所有的片段都包含在同一个衣壳中。不过，也有些病毒将片段基因分布在不同的病毒粒子中（如：雀麦花叶病毒），但它们能够成功地侵染同一宿主。,许多植物及动物病毒的正链RNA基因组5端具有7-甲基鸟嘌呤核苷帽子结构，3末端具有poly-A尾巴。,一少部分病毒具有dsRNA基因组，都是片段式的。,2、病毒的蛋白质,衣壳蛋白：占病毒蛋白质成分的绝大部分。保护核酸；当病毒无包膜结构时，衣壳参与病毒对宿主的吸附、侵染；决定病毒对宿主的专一性和病毒的抗原性。,包膜蛋白：包膜的脂质和碳水化合物是正常的宿主组成成分，但蛋白是由病毒基因编码形成的，可伸出包膜形成刺突。,存在于病毒中的酶类：病毒酶位于衣壳内，其中许多酶参与核酸的复制，例如，逆转录酶。也有些病毒的酶位于包膜或衣壳上（例如，流感唾液酸苷酶），协助病毒的侵染。,3、病毒的其它化学成分,包膜中含有丰富的磷脂和胆固醇、糖类，来源于宿主细胞；,少数无包膜的病毒也存在脂类；,一些病毒粒子中存在有机阳离子（如丁二胺、精胺）和无机阳离子。,第三节 噬菌体,一、噬菌体的分类,多数噬菌体可以按照其形态分为以下四类：无尾二十面体型 收缩尾型（结构最复杂，例如E.coli的T偶数噬菌体）非收缩尾型 丝状噬菌体,噬菌体分类的依据：宿主种类、免疫学关系等。但目前最主要的分类依据还是噬菌体的形态和核酸特性。,噬菌体的遗传物质可以是DNA，也可以是RNA，已知的大部分噬菌体的遗传物质是dsDNA。,核酸,形态,二、噬菌体的复制周期,裂解性生活周期：DNA噬菌体在宿主细胞内复制后，宿主细胞裂解并释放新噬菌体。（E.coli的T偶数噬菌体）,（一）双链DNA噬菌体的复制,1.一步生长实验,1）将适量噬菌体接种于培养好的高浓度敏感细胞中，使每个敏感细胞至多只能吸附到一个噬菌体。,2）使已吸附的噬菌体建立同步感染（稀释或抗体沉淀）,3）继续培养，定时取样，测定样品中病毒的滴度。,病毒的滴度（titer），又称效价，是指每毫升样品中含有的侵染性病毒粒子的数量。(双层平板法测),以感染时间为横坐标，病毒滴度为纵坐标，绘制定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线，称为一步生长曲线。,潜伏期：是从噬菌体吸附于宿主细胞表面到子代噬菌体释放所需的最短时间。包括：隐蔽（晦）期和胞内积累期。,裂解量：是每个受侵染的细胞所产生的子代噬菌体的数目。,两个重要参数,2.噬菌体的复制过程（烈性噬菌体的裂解周期）,（1）吸附和侵入,受体（吸附）位点：细胞壁上的脂多糖、蛋白质、磷壁酸，以及鞭毛和菌毛,附着 固着 尾部收缩 刺入细胞 DNA注入,T4噬菌体吸附和侵入宿主细胞过程：,如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多小孔，也可引起细胞立即裂解，但并未进行噬菌体的增殖，这种现象称为自外裂解（lysis from without）。,（2）噬菌体大分子的合成,早期mRNA：宿主RNA聚合酶开始合成的病毒mRNA，即噬菌体DNA复制前转录的mRNA。早期蛋白：早期mRNA翻译成的蛋白，这些蛋白将接管宿主细胞并合成病毒核酸。其中一些酶将宿主DNA降解成核苷酸，为病毒DNA的合成提供原料；一些蛋白对宿主细胞RNA聚合酶进行修饰，使其识别病毒的DNA启动子，开始转录合成中期mRNA。中期mRNA：即病毒DNA复制所需的酶的mRNA。,噬菌体DNA注入宿主细胞后，宿主细胞自身的DNA、RNA和蛋白质的合成便会中止，转而合成病毒复制所需的成分。,中期蛋白：中期mRNA翻译成的蛋白(DNA复制所需的酶、羟甲基胞嘧啶合成酶以及晚期mRNA聚合酶等)，病毒DNA开始复制(某些碱基的修饰是抵制宿主的限制)。多联体-合成的T4噬菌体DNA具有末端冗余(重复的一段碱基序列)，大约6-10个克隆通过末端冗余序列连接在一起，这种由若干单元同向相连形成的超长链DNA称为多联体，多联体在装配过程中被切割。晚期mRNA：DNA复制完成后合成的mRNA(指导结构蛋白、装配蛋白、溶菌酶等)。晚期蛋白：噬菌体的结构蛋白、装配蛋白、溶菌酶等这些细胞裂解期间合成的蛋白质。,（3）噬菌体的装配,T4噬菌体的装配是一个极为复杂的自我装配的过程。,大致分为4个独立的途径：,1）头部壳体装入DNA形成成熟的头部,2）由基板、尾管、尾鞘组装成无尾丝的尾部；,3）头部与尾部自发结合；,4）装上尾丝,头部,衣壳粒,DNA,衣壳,尾部,尾鞘,噬菌体,尾丝,（4）噬菌体的释放,37培养时，侵染约22分钟后，E.coli发生裂解并释放约300个T4噬菌体。这一过程需要一些T4基因的支持：一种基因指导溶菌酶的合成，溶菌酶可以攻击细胞壁的肽聚糖；另一种噬菌体蛋白称为holin，它可破坏细胞膜，使溶菌酶到达并破坏细胞壁，同时阻止细胞膜上的能量代谢反应。,（二）单链DNA噬菌体的复制,(1)X174噬菌体DNA进入宿主细胞后，利用宿主DNA聚合酶以单链DNA为模板合成双链模式(复制型DNA或RF DNA);(2)随后复制型DNA将指导合成更多的RF DNA、mRNA和+DNA基因组，mRNA翻译成病毒蛋白；(3)此类噬菌体的裂解和释放机制和T4噬菌体基本相同。,E.coli噬菌体X174的遗传物质是单链DNA。其DNA序列与病毒mRNA相同，即为正链，其基因组中有重叠基因（overlapping genes）。,复制过程,1.X174,复制过程,2.丝状ssDNA噬菌体(如：fd噬菌体),(1)丝状噬菌体通过附着于大肠杆菌性菌毛而侵染宿主细胞。(2)噬菌体DNA在吸附蛋白协助下沿着或通过菌毛注入宿主。(3)噬菌体DNA首先合成复制型DNA，然后进行转录，噬菌体DNA以滚环模式进行复制。,丝状ssDNA噬菌体单链DNA为环形，位于衣壳中心。其复制过程不同于X174噬菌体或其他ssDNA噬菌体。,A-蛋白,细胞壁,细胞膜,衣壳蛋白,噬菌体ssDNA,C-蛋白,(4)子代颗粒的装配是在噬菌体DNA穿过宿主细胞外膜时完成并分泌出来，不引起细胞破裂，但降低细胞生长速率。,（三）RNA噬菌体的复制,MS2是E.coli的单链RNA噬菌体。吸附宿主的性菌毛，RNA进入宿主。其RNA只有34个基因，分别编码与吸附有关的蛋白、衣壳蛋白、RNA复制酶和细胞裂解蛋白。,+RNA,翻译,RNA复制酶,RNA(ds),+RNA,可作为mRNA,噬菌体蛋白,其单链RNA为正链，可作为mRNA指导噬菌体蛋白合成,组装成噬菌体,（四）其它类型RNA噬菌体（病毒）的复制,+RNA,反转录酶,DNA(ds),+RNA,可作为mRNA,噬菌体蛋白,组装成噬菌体,反转录病毒,+RNA,DNA,DNA聚合酶,DNA链为模板,该DNA具有侵染性，并可以整合到宿主细胞的DNA分子上,转录,转化蛋白,+,能把宿主细胞转化成肿瘤细胞,RNA病毒,RNA,转录,+RNA,可作为mRNA,RNA复制酶等蛋白,+RNA,RNA,可作为mRNA,噬菌体蛋白,可作为病毒核酸,组装成噬菌体,目前发现的唯一一种dsRNA噬菌体，以铜绿假单胞菌为宿主。还不清楚该噬菌体如何复制。,6噬菌体,