实验二 、培养基及胰酶的配制.ppt

实验二、培养基及胰酶的配制,一、实验原理：（一）细胞培养的气体环境与pH环境(二）细胞培养的营养条件 1.培养用液 培养液（基）、缓冲液、平衡盐溶液、血清及消化液、pH调节液和抗生素等。,血清的主要成分及含量,培养基的主要种类（基础培养基）(1)MEM(低限量基础培养基，minimum eessential media):(2)DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium)(3)IMDM(Iscoves modified Dulbeccos medium)(4)RPMI1640(5)HamF10、HamF12(6)McCoys 5A,消 化 液 0.1-0.25%胰酶 0.02%EDTA pH=8.0,二、实验目的1.掌握DMEM培养基、胰酶的配制2.学习针头滤器的使用方法,三、实验步骤(一）DMEM培养基的配制1.三袋DMEM粉末用双蒸水溶解（先加入2/3DDW，再用DDW冲洗袋子）、磁力搅拌器搅拌半小时以上。2.加入1.2g/袋 NaHCO3定容3000 mL、搅拌30分钟。每人在超净台内用大滤器过滤、分装、写好种类、名字。（留取少许做污染测试放CO2培养箱72小时）3.每8个人为一组，每人过滤90 mL，其余的过滤到100 mL试剂瓶中，每瓶90mL培养基备用。使用前在超净台内加入56灭活好的FCS 10 mL，使血清的终浓度为10%，4保存待用。,（二）胰酶的配制1.取实验一中准备好的DHanks 液 200 mL（8人一组）2.称取0.5g胰酶（0.25%）放入研磨器中并加入少量D Hanks液成为糊状，研磨200次，再加入D Hanks液终体积为200ml，合并胰酶，加0.02%EDTA助消化，磁力搅拌使之完全溶解。（8人一组，分别研磨，再合并）3.用NaHCO3 调pH至8.0。4.小滤器（实验一中已湿热灭菌过的）过滤除菌至小瓶内,(不能装的过满,防止冷冻后瓶爆裂)、检查滤器、贴好标签、-20保存。每人过滤20 mL。（注意：1.拧紧滤器2.注射器吸液体3.注射器插好滤器4.对着烧杯慢推压针芯看是否漏5.如不漏对小瓶过滤。6.滤器放在小瓶瓶口上，取下针头再吸液体，反复多次，滤完。7.检查滤器滤膜是否完好。）,四、思考题1.细胞培养中为什么添加血清？2.使用血清需注意哪些方面？3.消化液胰酶的浓度是多少？4.使用小滤器过滤要注意哪些？,