《学生-实验基础》PPT课件.ppt

第二十六章毒理学实验基础,第一节毒理学实验设计要求第二节 实验动物的染毒和处置第三节优良实验室规范,2,第一节毒理学实验设计要求,目的和意义毒理学实验设计内容 确定实验动物及数量确定剂量或浓度 重复原则随机分组原则对照原则伦理原则,3,一、确定实验动物（一）实验动物物种的选择,对实验动物物种选择的基本原则是：选择对受试物在代谢、生物化学和毒理学特征与人最接近的物种；自然寿命不太长的物种；易于饲养和实验操作的物种；经济并易于获得的物种。,4,（二）实验动物品系的选择,品系(strain)是指用计划交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物。即具有相似外貌特征，独特的生物学特性以及稳定的遗传性能，共同遗传来源和一定遗传结构的动物群体。例如，C57BL/6是近交系动物中的一个品系，属低癌组、高补体活性的动物。,5,作为一个品系应具备以下条件：,相似的外貌特征独特的生物学特性稳定的遗传性能具有共同遗传来源和一定的遗传结构,6,1、实验动物按遗传学控制分类,近交系动物 远交系动物实验动物 突变系动物 杂交群动物,7,（1）近交系动物(inbred strain),近交系(inbred strain)：指至少经连续20代以上全同胞交配或亲子交配培育而成，品系内所有个体都可追溯到起源于20代或以后代数的一对共同祖先，近交个体的基因纯合程度可达98.6以上的遗传群体。,8,近交系的特征,基因纯合性(homozygosity)遗传稳定性(stability)遗传同源性(isogenicity)表型一致性(uniformity)个体性(individuality)可分辨性(identification)分布的广泛性,9,近交系动物的应用 实验组和对照组都只需少量的动物。在某些涉及组织、细胞或肿瘤移植的实验中，近交系动物成为必不可少的实验材料。,10,可能成为生理、胎胚发育和医学研究的模型。多个近交系同时使用，可使不同研究者分析不同遗传组成对某项实验的影响，或者观察实验结果是否具有普遍意义。,11,（2）突变系动物(mutant strain),突变系动物是具有特殊突变基因、并伴有各种遗传缺陷的品系动物。,12,特点,突变系动物可以作为人类疾病的动物模型而在生物医学的研究中应用。众多的突变系动物的出现给生物医学研究提供了重要的工具-疾病模型，有不少突变品系动物的疾病与人类疾病极为相似。多为病态，生活能力较差，对饲养管理要求更为严格，繁殖保种较为困难。,13,（3）封闭群动物（closed colony）,封闭群动物又称远交系，是指一个动物种群，在5年以上未从外部引进其他任何新血缘品系，是由同一血缘品系进行随机交配，并在固定场所保存繁殖的动物群。常见者如：NIH小鼠、Wistar大鼠、KM小鼠、青紫蓝兔、新西兰兔和豚鼠等，均属这类动物。,14,特点：,一定的杂合性：不引入新的基因，又不使 群体内基因丢失。相对的稳定性：群体在一定范围内保持相 对稳定的遗传特征。个体差异取决于祖代动物。较强的繁殖力、抗病力。群体易保存有模型价值的突变基因。,15,（4）杂交群动物(hybrid stock),杂交群动物又称异系杂交或系统杂交动物，是两个近交品系动物间有计划进行交配获得的第一代动物，亦称杂交一代，简称F1代动物。,16,特点：,杂交优势，克服了近交引起的近交衰退遗传与表型上的均质性分布广泛。不具有育种功能,17,1、无菌动物（germfree animal，GF）：指用现有检测技术在动物体内外的任何部位均检不出任何活的微生物和寄生虫的动物。来源于剖腹产或无菌卵孵化，饲养于隔离系统中。,（三）实验动物等级的选择 等级是指实验动物的微生物标准化程度。,18,无菌动物的特点,形态学改变：消化系统:盲肠膨大，肠壁菲薄，易发生盲肠扭转，导致破裂。循环系统：心脏变小。免疫系统：胸腺上皮细胞变大，胞浆泡状结构和溶酶体变小。,19,生理学改变,免疫功能：免疫应答慢，过敏反应、对异体移植物 的排斥反应以及自身免疫现象消失或减弱。生长率：豚鼠、兔生长率降低，大、小鼠改变不大。代谢：水分代谢周期延长，肠管对水的吸收率低。营养：体内不能合成VitB、VitK。抗辐射能力：增强。寿命：长于普通动物。,20,2、悉生动物(gnotobiotic animal GN),悉生动物：或称已知菌动物，广义上把无菌动物、已知菌动物、无特定病原体动物统称悉生动物；狭义上指已知菌动物。,21,悉生动物的特点,GN动物是动物与微生物的共生复合体。肠道存在能合成维生素和氨基酸的细菌，不会出现维生素缺乏症。生活力、抵抗力明显增强，易于饲养。,22,3、无特定病原体动物(SPF):,指动物体内无特定的微生物、寄生虫存在，但带有非特定的微生物、寄生虫的动物。主要指不携带潜在感染、条件致病和对实验干扰大的病原。来源于剖腹产动物。小鼠病原菌应排除16种，病毒11种；大鼠病原菌应排除16种，病毒7种。,23,4、清洁动物(Clean animal),除普通动物应排除的病原外，不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原。来源于SPF动物或剖腹产动物。血清病毒抗体检测可检测出一定滴度的抗体，病理切片应无病变。小鼠病原菌应排除10种，病毒5种；大鼠病原菌应排除10种，病毒2种。,24,5、普通动物(conventional animal CV),定义：不携带人兽共患病病原和动物烈性传染病病原的实验动物。特点：微生物控制要求最低。生理学特性：健康的外貌，正常的饮食，眼角、鼻腔 无分泌物附着，尸检无眼观病灶。,25,（四）个体的选择年龄和体重性别生理状态和健康状况,26,（五）确定实验动物的数量,实验动物还需要有一定的数量，例数不能太少，也不宜过多。大样本的代表性优于小样本，但样本过大会加大工作量，而且成本也相应提高。长期实验还应考虑实验动物因疾病或操作不当等原因引起的动物数量减少，应适当增加每组的动物数。一般来讲，每组小鼠和大鼠数一般不少于10只，犬一般不少于6只。,27,二、确定剂量或浓度,不同实验方法、不同实验模型、不同动物实验所需化学物剂量不同。毒理学研究所应用的剂量应产生下列作用：至少有一个剂量产生明显的毒作用甚至可能发生死亡；至少有另一剂量产生轻度的毒性而不发生死亡；至少还有一个剂量不产生可观察到的毒作用。对照组的动物可做相同的处理，但不给受试物。应尽量确定不良反应的量效关系和时效关系（如不良反应的发生和持续时间）.至少应设三个剂量组。低剂量应相当于主要毒效学的有效剂量，高剂量以不产生严重毒性反应为限。,28,三、重复（replication）原则任何毒理学实验必须用多于一个以上的实验单位，如实验单位可为一个动物、一窝子代等。由于实验单位存在一定变异，可引起实验效应的误差，因此只有达到或满足一定数量的实验单位才可提供更准确的实验效应。,29,四、随机化（randomization）原则分组随机化是指用随机数字或其他随机化的电脑程序将选定的实验单位进行随机分组或随机抽样。实验设计中的随机化就是将实验单位进行随机分组。例如，将一批受试者按等概率分为A和B两组，可以用随机数字的奇偶决定每个受试者的组别。,30,随机化的目的是：使各处理组的实验单位具有相同的特征，避免实验者因主观和客观因素产生的偏移对分组结果的影响，减少系统误差。随机化是保证组间实验对象具有可比性，避免数据结果的偏性的有效手段。,31,五、对照（control）原则 有比较才有鉴别，设置对照的目的就是在同样的实验条件下，验证新的处理效应与已知或公认的结果有无差异。或者说设立对照可以使处理因素和非处理因素的差别有一个科学的对比，从而消除非处理因素对实验结果的影响，把处理因素的效应充分显示出来。设立对照是抵消各种非处理因素造成误差的基本措施。,32,毒理学中常用的对照形式1.空白对照 指不给予任何干预因素的对照组，即对照组的处理因素为“空白”。2.阳性对照 采用已知阳性物质做对照。作为阳性对照的物质的效应必须是肯定或学术界公认的。受试化合物与阳性对照比较应在相同条件下进行，如溶剂剂量、给药方法和采样时间等。设置阳性对照组的主要目的是检测实验体系的有效性。,33,3.阴性对照 不给要研究的处理因素,但给以其他的实验因素,以排除这些实验因素的影响。常用的阴性对照是溶剂/赋形剂对照,以此作为与染毒组比较的基础。阴性对照除了要研究的因素外,其他处理应和实验组完全相同。,34,4.自身对照 同一研究对象自身处理前后互为对照。采用这种对照时,要求研究因素处理前后的实验条件必须一致,观察指标应是稳定的。5.历史对照 同一实验室过去多次实验的对照组数据组成的历史对照可用于实验室质量的控制和保证。过去的研究资料可用于研究结果的比较,但需注意资料的可比性。,35,（一）动物福利法的起源 1822年，人道的迪克马丁提出的禁止虐待动物的议案“马丁法令”获得了通过。这是首次以法律条文的形式规定了动物的利益，保护动物免受虐待，是动物保护史上的一座里程碑。人们对待动物的态度从此开始了微妙的变化。,六、动物实验设计的伦理原则,36,现在，动物福利制度已在世界范围内迅速发展起来。英国现行的动物保护法是1911年通过的，目前英国正在修改这部法律。除了1911年通过的动物保护法之外，英国还陆续出台了很多专项法律，比如野生动物保护法、动物园动物保护法、实验动物保护法、狗的繁殖法案、家畜运输法案等。自1980年以来，欧盟及美国、加拿大、澳大利亚等国先后都进行了动物福利方面的立法。动物福利组织也在世界范围内蓬勃发展起来，WTO的规则中也写入了动物福利条款。,37,根据各国现有的动物福利法的历史及渊源的考察，满足动物的需求是动物福利法的首要原则。动物的需求主要表现在以下三个方面：维持生命需要，维持健康需要及维持舒适需要。,（二）动物福利的立法宗旨和福利标准,38,解除动物痛苦，让动物在任何条件下享有如下五大自由是动物福利法的基本原则：1.享有不受饥渴的自由；2.享有生活舒适的自由；3.享有不受痛苦伤害和疾病的自由；4.享有生活无恐惧和悲伤感的自由；5.享有表达天性的自由。这也是目前国际动物福利一致认同的五大标准。只有当上述动物需求得到满足时，动物才能身心愉悦，享受大自然赋予的生命的乐趣。,39,（三）我国实验动物福利立法的有关问题,我国现行的有关动物保护的法律为数不多，动物保护的范围也过于狭隘，欠缺了哪一方面都不算完整的动物保护。除野生动物保护法、动物检疫法等几部单行法外，余者只散见于森林法、渔业法、海洋环境保护法等若干零散条文中，没有一部专门的、完整的动物保护的总括性法律。因而，人们对于如何保护动物，以及保护动物的意义都缺乏整体的清晰印象。对实验动物来说，明确其法律地位是解决福利问题先决条件。,40,关于发布关于善待实验动物的指导性意见的通知国科发财字2006398号为了适应科技发展的需要，贯彻落实实验动物管理条例（中华人民共和国国家科学技术委员会令第2号，1988），进一步加强实验动物管理工作，我们在深入研究和广泛征求意见的基础上，制定了关于善待实验动物的指导性意见，现予印发，请认真贯彻落实。科学技术部 二六年九月三十日,41,（四）动物实验的“3R”原则 动物实验替代方法的研究是在科学研究领域，采用科学的方法研究动物福利，在符合科学目的前提下通过采用更为合理的手段，充分体现动物福利的科学实践活动。而3R研究的最终目的则是为生命科学及相关领域的研究提供有效的研究手段，使科学研究方法更加科学化，试验结果更加准确、可靠。,42,3 R的概念及内涵,3R是Reduction、Replacement和Refinement的简称。（1）Reduction（减少）是指在科学研究中，使用较少量的动物获取同样多的试验数据或使用一定数量的动物能获得更多实验数据的科学方法。对一个实验来讲，用动物越多，则成本就会随之提高。因此，动物的使用量应是能达到实验目的的最小用量。绝不能以节省时间或为了人员的方便以及其他不科学的原因为理由，使用超过能获取有意义的实验结果所需要的最少动物数量。,43,(2)Replacement（替代）是指使用其它方法而不用动物所进行的试验或其他研究课题，达到某一试验目的。或者说是使用没有知觉的试验材料代替以往使用神志清醒的活的脊椎动物进行试验的一种科学方法。,44,替代有不同的分类方法：,根据是否使用动物或动物组织，替代方法可分为相对性替代和绝对性替代两个方面，前者是指采用人道的方法处死动物或使用细胞、组织及器官进行体外试验研究，或利用低等动物替代高等动物的实验方法；后者则是在实验中完全不用动物；按照替代物的不同，可分为直接替代（如志愿者或人类的组织等）和间接替代；根据替代的程度，又可分为部分替代（利用其他替代实验手段来代替动物实验中的一部分或某一步骤）和全部替代（用新的替代方法取代原有的动物实验方法）。,45,指在符合科学原则的基础上，通过改进条件，善待动物，提高动物福利；或完善实验程序和改进实验技术，避免或减轻给动物造成的与实验目的无关的疼痛和紧张不安的科学方法。优化包括诸多内容，总体说来是一个科学化、规范化、标准化的过程，包括实验动物和动物实验两个方面。研究内容涉及到试验设计、实验技术、仁慈终点、人员的培训、饲养环境及设施、动物运输、动物自然习性等方面，其中动物实验程序的优化是一项主要内容。,(3)Refinement（优化）,46,3 R研究的意义（1）作为提升突破技术壁垒能力的载体和具体体现“标尺”，在经济发展和国际贸易中发挥不可替代的重要作用。,47,（2）为科学发展提供了新思路和新方法 纵观3R概念的提出和发展，可以说它一方面是为了适应动物保护主义运动、缓和动物保护与动物试验之间日益尖锐的矛盾冲突的一种需要。另一方面，从3R研究成果的应用来看，确实对科学的发展起到了很大的推动作用。因此说，3R研究也是科学发展的需要。,48,（3）开展“3R”研究，从保护动物，或是关注动物福利，这也是时代发展、社会进步在科学技术上的一种体现。,