《天然药化总论》PPT课件.ppt

天然药物化学,天然药物化学是药学类的一门专业课，通过该课程的教学，同学们能够掌握天然药物中的主要类型成分的结构特征、理化性质、提取、分离，精制及结构鉴定的基本理论和技能。能够了解天然药物化学成分结构测定的一般原则和方法，以及寻找研究天然药物的有效成分的途径，为开发研究新药奠定基础。,教材及参考书,第一节、绪论,第二节、生物合成,第三节、提取分离的方法,第四节、结构研究方法,第一章 总论,1、掌握天然药物化学的含义、研究对象、性质与任务；2、掌握天然药物有效成分提取分离的一般原理及常用方法；3、掌握天然化合物结构研究的一般步骤和常用方法；4、熟悉不同的生物合成途径；5、了解天然药物化学的发展历史、研究成就及发展趋势；6、了解天然药物化学与药学相关学科的关系。,教学要求,天然药物化学的研究内容天然药物化学的简要发展历程天然药物化学学习重点,第一节 绪 论,一、天然药物化学的研究内容,定义：天然药物化学是药物化学的一个分支学科。是应用现代科学理论和方法研究天然药物（包括动物、植物、海洋生物、微生物代谢产物等）中化学成分的一门学科。,第一节 绪 论,天然药物中化学成分,结构特点,理化性质,提取分离,结构测定,生物合成,研究内容：,（1）植物药物（2）动物药物（3）矿物药物（4）海洋生物（5）微生物及内源性生物活性物质,2.天然药物的来源,第一节 绪论,有关一些概念：中草药成分化学 天然有机化学天然产物化学 植物化学化学成分 有效成分生物活性成分 有效部位,化学成分：天然药物中含有的各种化学物质。如生物碱、黄酮类化合物、皂苷、挥发油等。如中药麻黄中含有左旋麻黄素等多种生物碱以及挥发油、淀粉、树脂、叶绿素、纤维素、草酸钙等化学成分；中药甘草中则含有甘草酸等多种皂苷以及黄酮类、淀粉、纤维素、草酸钙等化学成分。,有效成分：即药材中代表其功效的化学成分。如左旋麻黄素(l-ephedrine)具有平喘、解痉作用，甘草酸(glycyrrhizin)具有抗炎、抗过敏、治疗胃溃疡的作用，分别被认为是麻黄及甘草中的代表性有效成分。,生理活性成分：即经过不同程度药效试验或生物活性试验，包括体外（in vitro）及体内（in vivo）试验，证明对机体具有一定生理活性的成分。,有效部位：指一味中药或复方中药提取物中的一类或几类化学成分被认为是有效成分时，该一类或几类化学成分的混合体被认为是有效部位，如：总生物碱、总皂苷或总黄酮等。,二、天然药物化学的发展简史,（1）天然药物化学的建立与形成“植物中有机酸的研究促成有机化学及植物化学的形成”,国外,1769年 酒石酸1775年 苯甲酸1778年 乳酸年 苹果酸年 没食子酸,中国古代,1575年 没食子酸1711年 樟脑,医学入门,集验方,舍勒,1803 1806吗啡(鸦片),德罗逊(Derosen)斯托勒(Sertrner),1818 士的宁碱1820 咖啡因1820 喹宁1828 尼古丁1831 阿托品1833 乌头碱,morphine,Morphine为第一个从天然界分离的生物活性成分，生物碱的研究是天然药物化学发展的开端。,1）合成药物的工业化生产制约了天然药物化学研究 二十世纪 三十年代：磺胺药(1935)、维生素问世 四十年代：盘尼西林的使用 五十年代：形成了新药上市的黄金时代 2）药害震惊全球,Thalidomide,西德1956年出售镇静药“反应停”肽胺哌啶酮到1962年就引起数千例畸胎。,(2)天然药物化学的兴衰,利血平(Reserpine),（3）大规模寻找天然活性物质大量特殊生物活性天然物质的发现,1、微量物质2、水溶性物质3、不稳定物质4、海洋生理活性物质5、生物体内源性生理活性物质,天然药物化学的发展趋势,morphine从1803年分离到1952年合成计150年,Reserpine只花了4年,morphine,提取分离:1803-1806提出结构:1925合成证实:1952,结构鉴定技术的进步推动了学科的飞速发展,发 现确 定 结 构人工合成证实,Reserpine,1952-1956,沙海葵毒素（C129H223N3O54）,三、天然药物化学与新药发现,第一节 绪论,青蒿 青蒿素的化学结构 立体结构,世界卫生组织统计数据显示，目前世界植物药市场年销售额超过世界卫生组织统计数据显示，目前世界植物药市场年销售额超过 160 亿。,日本的汉方药：80韩国的韩药：15中国中草药：3-5,第二节 天然化合物的生物合成,一、一次代谢及二次代谢二、生物合成的基本构建单元三、生物合成途径 四、生物合成的意义,这些是植物生存不可缺少的物质，该过程存在于所有的绿色植物中，称为一次代谢过程，产生的物质称为一次代谢产物。,1、一次代谢：,第二节 天然化合物的生物合成,一、一次代谢及二次代谢：,植物体内的物质代谢与生物合成程,三羧酸循环（TCA）丁酮二酸-酮戊二酸丁二酸,鞣酸类,CO2 H2O,h/叶绿素,磷酸烯醇式丙酮酸,甲戊二羟酸,丙酮酸,丙二酸单酰辅酶A,赤藻糖4-磷酸,葡萄糖代谢,莽草酸,苯丙素类,芳香族氨基酸,脂肪族氨基酸,嘌呤、嘧啶,脂肪酸类,萜 类,甾 醇,胡萝卜素类,生物碱类,肽 类,含氮化合物,香豆素、木脂（质）素,黄酮类,-氨基乙酰丙酸,核苷,核苷酸类,醌 类,胆 碱,卟啉类,前列腺素类,脂肪族及芳香族聚酮类,乙酰辅酶A,这些物质对植物生命活动不起主要作用，该过程不是存在所有的绿色植物中，产生的生物碱、萜类等化合物称为二次代谢产物。,2、二次代谢：,生物碱、萜类,黄酮、蒽醌等,第二节 生物合成,二、生物合成的基本构建单元,1、C1单元：多来源于L-蛋氨酸的S-甲基（如甲基）2、C2单元：多为乙酰辅酶A的两碳单位（如脂肪酸、酚类、苯醌等聚酮类）3、C5单元：来源于甲戊二羟酸或去氧木酮磷酸酯代谢产物（如萜类、甾类）,4、C6C3单元：多由L-苯丙氨酸和L-酪氨酸转化5、C6C2N单元：前体为L-苯丙氨酸和L-酪氨酸6、吲哚C2N单元：L-色氨酸中吲哚环7、C4N单元：来源L-鸟氨酸8、C5N单位：,二、生物合成的基本结构单元,（一）醋酸丙二酸途径（AA-MA途径）1.脂肪酸类2.聚酮类3.酚及芳聚酮类,三、生物合成途径,（二）甲戊二羟酸途径和脱氧木酮磷酸酯途径1.甲戊二羟酸途径(MVA途径）合成成分类别：萜类、甾体类2.脱氧木酮糖磷酸酯途径（DXP途径）,三、生物合成途径,（三）莽草酸途径1.芳香氨基酸和简单苯甲酸类2.桂皮酸途径（苯丙酸、香豆素、木脂素、黄酮）3.醌类化合物（四）氨基酸途径 生物碱类,三、生物合成途径,（五）复合途径,三、生物合成途径,四、生物合成的意义,有利于天然化合物的结构分类；有利于天然化合物的结构推测；指导植物化学分类学；指导仿生合成；指导组织培养生物活性物质；定向寻找生物活性成分；生物调控，提高活性成分的含量。,一、天然药物有效成分的提取 二、天然药物化学成分的分离与精制,第三节 提取分离方法,一、天然药物有效成分的提取,提取方法：溶剂提取法 水蒸气蒸馏法 升华法,（一）、溶剂提取法：1.溶剂提取法原理：渗透，溶出，扩散平衡影响提取效率:原料的粉碎度、提取时间、提取温度、设备条件等因素,一、天然药物有效成分的提取,2.溶剂的选择：,1.水：,2.亲水性有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮）：,3.亲脂性有机溶剂（石油醚、苯、乙醚、氯仿）：,（一）、溶剂提取法,常用的溶剂的极性：石油醚（低沸点-高沸点）二硫化碳四氯化碳三氯乙烯苯二氯甲烷乙醚三氯甲烷乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇乙腈水吡啶醋酸,（一）、溶剂提取法,3.溶剂提取方法分类：浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续提取法、超临界流体萃取法、超声波提取技术、微波提取法,（一）、溶剂提取法,（一）、溶剂提取法,浸渍法,1、烧瓶 2、渗漉筒,（一）、溶剂提取法,煎煮法,（一）、溶剂提取法,常压微波回流装置示意图1.微波炉 2.瓶架 3.蒸馏瓶 4.搅拌器 5.铜管6.冷凝管 7.开关 8.控制面板,分离和提纯液态或固态有机物的方法。适用于：具有挥发性的，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。,（二）、水蒸气蒸馏法,固体物质如樟脑等受热在低于其熔点的温度下，不经过熔化就可直接转化为蒸气，蒸气遇冷后又凝结为固体称之为升华。,（三）、升华法,二、天然药物有效成分的分离与精制,（一）根据物质溶解度的差别进行分离（二）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离（三）根据物质的吸附性差别进行分离（四）根据物质分子大小的差别进行分离（五）根据物质离解程度不同进行分离,(一)根据物质溶解度差别进行分离,1.改变温度：结晶与重结晶。2.改变混合溶剂极性：水/醇法：水提液+醇（数倍）：可沉淀多糖、蛋白性物 质（杂质）。醇/水法：醇提液+水（数倍）：可除去叶绿素、油脂等 杂质。,3.改变pH值：碱提酸沉（碱/酸法）：如提取黄酮、蒽醌类酚酸性成分 酸提碱沉（酸/碱法）：如生物碱类在用酸性水从药材中提出后，加碱调至碱性即可从水中沉淀析出。4.沉淀试剂：pb2+、Ca2+等金属离子可与酸、碱性化合物生成不溶于水的沉淀而析出。,(一)根据物质溶解度差别进行分离,常见的方法有：简单的液液萃取法、纸色谱、逆流分溶法（CCD)、液滴逆流色谱（DCCC)、高速逆流色谱（HSCCC)、气液分配色谱（GC或GLC)、液液分配色谱（LLC或LC),(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,1.液-液萃取与分配系数K、分离难易及分离因子（值）原理：利用两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同达到分离分配系数（K值）,K=CU/CL,(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,b=KA/KB,100，一次萃取就可实现基本分离100 10，需萃取1012次2，需萃取100次以上1，无法实现分离,(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,2.分配比与pH,溶剂系统pH的变化影响酸性、碱性、及两性有机化合物的存在状态（游离型或离解型），从而影响在溶剂系统中的分配比。游离型极性小的溶剂 离解型极性大的溶剂,(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,一般 pH12时，酸性物质多为离解状态（A-）碱性物质为非离解状态（B）,(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,用不同pH的缓冲溶液与有机溶剂分离酸性、碱性、中性及两性物质,(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,3.液-液萃取与纸色谱当50时，简单萃取即可，50时，则需采用逆流分溶法。纸色谱与液-液萃取的分离原理都是分配。Rf值与K值之间有下列关系 Kor/w=1/r(Rf/1-Rf),(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,当层析滤纸湿重（W湿）为干重（W干）的1.5倍时，r=2 设A、B两种（或两组）物质的Rf值分别为 Rfa 及 Rfb。=Rfa(1-Rfb/1-Rfa)/Rfa（Rfa Rfb）,(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,4.逆流分溶法（CCD）：又称逆流分布法或反流分布法，与两相溶剂逆流萃取法原理一致，对于分离具有非常相似性质的混合物效果较好。,0 1 2 3 n 图 CCD法的分离过程示意图,(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,5.液滴逆流分配法（DCCC）及高速逆流色谱（HSCCC)DCCC(液滴逆流色谱)和HSCCC(高速逆流色谱法):是在逆流分溶法基础上创建的色谱装置，可使流动相呈液滴形式在固定相间交换，分离效果好。多用于分离皂苷、蛋白质、糖类等。,(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,高速逆流色谱 逆流色谱是一种新型的分离手段，它的主要分离原理是利用样品在固定相和流动相之间的差异也就是分配比不同而进行分离的，值得注意的是逆流色谱的固定相和流动相都是液体，其主要优点是没有传统色谱的死吸附，样品的回收率高等特点。,(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,6.液-液分配柱色谱：1）正相色谱与反相色谱正相分配色谱：固定相：水、缓冲溶液流动相：固定相饱和的氯仿等弱极性有机溶剂洗脱顺序：化合物极性越小，越先出柱；反之，化合物极性越大，越后出柱。应用：通常用于分离水溶性或极性较大的成分,(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,反相分配色谱：固定相：石蜡油、化学键合固定相流动相：固定相饱和的水或甲醇等强极性有机溶剂洗脱顺序：化合物极性越大，越先出柱；反之，化合物极性越小，越后出柱。应用：适合于分离脂溶性化合物,(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,2）加压液相色谱法：分为：快速柱色谱，Lobar低压柱色谱，中压柱色谱，分析用HPLC，制备用HPLC。,(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,3)涡流色谱 在线萃取技术，可以实现生物样品的在线处理并可以直接用于分析检验。,(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,物理吸附化学吸附半化学吸附,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,物理吸附：也称表面吸附,由分子间力的相互作 用所引起。特点：无选择性，吸附与解吸可逆，可快速进行，故在实际工作中用得最广。如硅胶、氧化铝。,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,化学吸附：如黄酮等酚酸性物质被碱性氧化铝吸附，或生物碱被酸性硅胶吸附等。特点：有选择性，吸附牢固，有时不可逆，很少使用。半化学吸附：如聚酰胺对黄酮类、醌类等化合物之间的氢键吸附，力量较弱，介于上述二者之间。,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,物理吸附的基本规律基本要素：吸附剂、被分离物质、溶剂 物理吸附原理：吸附与解吸附的循环往复,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,1、吸附剂:常用的极性吸附剂：硅胶、氧化铝。适于分离非极性化合物。硅胶显微酸性，适于分离酸性和中性化合物，分离生物碱时需在流动相中加入适量的有机碱；氧化铝呈碱性，适于分离生物碱等碱性成分，不宜用于分离有机酸、酚性等酸性成分。常用的非极性吸附剂：活性炭。适于分离极性化合物。对非极性物质具有较强的亲和力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。从活性炭上洗脱被吸附的物质时，溶剂的极性越小，洗脱能力越强。,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,2、被分离物质,一般化合物的极性按下列官能团的顺序增强：CH2CH2，CH2=CH2，OCH3，COOR，C=O，CHO，NH2，OH，COOH,物质极性强弱的判断：,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,化合物的极性由官能团种类、数目、排列方式等因素决定(1)亲水性基团与极性成正比,亲脂性基团与极性成反比；(2)游离型化合物极性弱、具亲脂性,解离型化合物极性强、具亲水性；,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,溶剂的极性依据介电常数来决定,介电常数越大，则极性越大。一般溶剂的介电常数按下列顺序增大：环己烷（1.88），苯（2.29），无水乙醚（4.47），氯仿（5.20），乙酸乙酯（6.11），乙醇（26.0），甲醇（31.2），水（81.0）,3、溶剂,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,4、吸附柱色谱法用于物质的分离：,柱层析的基本步骤：1）装柱：(吸附剂的用量为试样量的3060倍）2）加样:（尽量选用极性小的溶剂装柱）3）洗脱：极性宜逐渐增加,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,5、聚酰胺吸附色谱法,聚酰胺的性质及吸附原理,不含水的溶剂中，是极性吸附与硅胶原理相似。,分离有两种原理：,在含水的溶剂中，是氢键吸附。,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,在水溶液中，有下列规律：,1）形成氢键的基团的数目越多，则吸附能力越强。,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,2）易形成分子内氢键者，其在聚酰胺上的吸附相应减弱,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,3)分子芳香化程度高者，则吸附作用增强，反之减弱。,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,洗脱能力由弱至强 水甲醇丙酮氢氧化钠水溶液甲酰胺甲基甲酰胺尿素水溶液,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,应用：A、特别适合于酚类、黄酮类化合物的制备和分离B、对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其它极性与非极性化合物的分离也有着广泛应用。C、用于提取物的脱鞣质处理。,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,从某植物中分离得到以下三个物质，1）在硅胶、聚酰胺TLC上，以氯仿-甲醇-丁酮-丙酮(40：20：5：1)展开时，Rf值的大小比较。2）若使用聚酰胺柱层分离时，以不同浓度的甲醇进行洗脱，洗脱先后顺序。,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,（1）吸附原理：大孔吸附树脂是吸附性和分子筛性原理相结合的分离材料。（2）组成：非极性型以苯乙烯为母体，二乙烯苯为交联剂；中极性型以2-甲基苯烯酸甲酯为母体，二乙烯苯为交联剂。,6、大孔吸附树脂,（3）影响吸附的因素A、非极性化合物在水中易被非极性大孔树脂吸附；极性化合物在水中易被极性大孔树脂吸附。物质在溶剂中的溶解度大，树脂对此物质的吸附力就小；反之就大。能与大孔吸附树脂形成氢键的化合物易被吸附。,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,B、洗脱剂的极性：洗脱液:甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。（乙醇/水）最常用。对于非极性大孔吸附树脂，洗脱液极性越小，洗脱能力越强；对于中极性的大孔吸附树脂和极性较强的化合物，洗脱液应选用极性较大的溶剂。C、pH的影响D、温度、流速等,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,（4）应用范围 A、苷类与糖类的分离；B、生物碱的精制；C、多糖、黄酮类、三萜类化合物的分离等。注意事项：A、大孔吸附树脂使用前需要用乙醇预处理；B、水溶液上柱，醇梯度洗脱。,(三)根据物质吸附能力差异进行分离,(四)根据物质分子大小差异进行分离,常用方法 透析法(dialysis)凝胶滤过法(gel filtration)超滤法(ultrafiltration)超速离心法(ultracentrifugation)膜分离法(membrane separation),凝胶滤过法(gel filtration),凝胶色谱简单原理图1.待分离的混合物在色谱床表面 2.试样进入色谱床，小分子进入凝胶颗粒内部，大分子随溶液流动 3.大分子物质行程短，流出色谱床，小分子物质仍在缓慢移动,凝胶滤过法(gel filtration),常用凝胶的种类及性质葡聚糖凝胶（Sephadex G)系列:G-10,15,20,25,50,75,100,200Sephadex G系列只适于在水中应用羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20):Sephadex LH-20即能在水中也能在有机溶剂中以及水组成的混合溶剂中应用。,凝胶滤过法(gel filtration),常用凝胶的种类及性质羧甲基交联葡聚糖凝胶（CM-Sephadex)二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶（DEAE-Sephadex)磺丙基交联葡聚糖凝胶（SP-Sephadex)苯胺乙基交联葡聚糖凝胶（QAE-Sephadex)丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P）琼脂糖凝胶（Sepharose Bio-Gel A）,膜分离技术(membrane separatione),基本原理：膜提取分离技术的应用原理近似机械筛，是以压力为推动力，实现溶质与溶剂的分离。类型：按照分离功能分为微滤、超滤、纳滤、反渗透特点：常温操作，无相变，能耗低。,(五)根据物质解离度差异进行分离),天然有机化合物中，具有酸性、碱性及两性基团分子在水中多呈解离状态，据此可用以下进行分离常用方法 电泳技术(electrophoretic method)离子交换法(ion-exchange chromatography),(五)根据物质解离度差异进行分离),1、离子交换法分离物质的原理 天然有机化合物中，具有酸性、碱性及两性基团分子在水中多呈解离状态而与离子交换树脂上的交换基团发生交换被吸附。交换基上的活性离子（H+或OH-）在水溶液中与其它阴、阳离子的可逆交换来达到逐步分离的目的。当两种（或两种以上）不同的可交换物质离子通过离子交换树脂柱时，各不同成分的亲和力不同，在柱上的交换速度也不同，被洗脱的时间也就不同，从而达到分离目的。,(五)根据物质解离度差异进行分离),2、离子交换树脂的结构及性质,图 强酸性阳离子交换树脂的结构,（1）母核部分：苯乙烯通过二乙烯苯交联（2）离子交换基团 阳离子交换树脂 强酸性（）弱酸性（）阴离子交换树脂 强碱性（）弱碱性（，）,(五)根据物质解离度差异进行分离),3.离子交换法的应用：A、用于不同电荷离子的分离：分离酸性、碱性及两性化合物。B、用于相同电荷离子的分离：如同为生物碱，但碱性强弱不同，也可应用离子交换树脂实现分离。,(五)根据物质解离度差异进行分离),离子交换树脂的实际操作过程：提取：B+H+Cl-=BH+Cl-树脂转型 R-SO3-Na+H+Cl-R-SO3H+Na+Cl-交换 R-SO3H+BH+Cl-R-SO3-（BH）+HCl 碱的提取 R-SO3-（BH）+NH4+OH-R-SO3-（NH4）+H2O+BCHCl3回流提取生物碱,(五)根据物质解离度差异进行分离),离子交换法分离示意图 试样 强酸型阳离子交换树脂(H型)流出液 氨水洗脱液（酸性、中性化合物）（碱性、两性化合物）强碱型阴离子交换树脂(OH型)强碱型阴离子交换树脂(OH型)稀NaOH洗脱 稀HCl洗脱 流出液 洗脱液 流出液 洗脱液（中性化合物）（酸性化合物）（碱性化合物）（两性化合物）,(五)根据物质解离度差异进行分离),碱性强弱不同（IIIII）,三者混合物的水溶液通过NH4+型弱酸性树脂，随后先用水洗下（），继续用NH4Cl洗下（II），最后用Na2CO3洗下（III）。,（六）分子蒸馏技术,原理：利用液体分子受热会从液面逸出，而不同分子逸出后平均自由程不同而实现分离。特点：温度低。蒸馏压强低，受热时间短、分离程度高应用：高沸点物质分离、热敏物质分离,小结,四、结构研究法,化合物的纯度测定结构研究的主要程序结构研究中采用的主要方法,一、化合物纯度的判定,（一）化合物的结晶形状、色泽和熔点固体物质还可通过检查有无均匀一致的晶形，有无明确、敏锐的熔点；液体物质还可通过测定沸点、沸程、折光率及比重等判断其纯度。对已知物来说，无论是固体还是液体物质，如其比旋度与文献数据相同，则表明其已是或接近纯品。（二）薄层色谱法(TLC)注意：一般样品用三种以上差别较大的溶剂系统或色谱条件进行检测，均显示单一的斑点时方可确认其为单一化合物。（三）气相色谱（GC）或高效液相色谱（HPLC）,初步推断化合物类型：理化性质、文献调研、TLC/PC等。测定分子式，计算不饱和度：元素分析；高分辨质谱等。确定分子中含有的官能团/结构片断/基本骨架:谱学性质等。推断并确定分子的平面结构：文献调研、光谱分析等推断并确定分子的立体结构：CD(圆二色谱)/ORD(旋光光谱)NOE/NOESY/2D-NMR、X-ray分析。,二、结构研究的主要程序,（一）分子式的确定与不饱和度的计算测定分子式 1.元素定量分析配合分子量测定 2.同位素丰度比法 3.高分辨质谱法（HR-MS）,三、结构研究中采用的主要方法,高分辨质谱仪可将物质的质量精确测定到小数点后第三位。不仅可给出化合物的精确分子量，还可以直接给出化合物的分子式。如青蒿素的HR-MS谱中,分子离子峰为m/z 282.1472，可计算出其分子式为C25H22O5（计算值，282.1467）,高分辨质谱法（HR-MS）,三、结构研究中采用的主要方法,确定分子式，计算不饱和度，不饱和度计算公式：I III=IV-+1 2 2I:一价原子（如H,X）的数目;III:三价原子（如N,P）的数目；IV:四价原子（C,S）的数目。,计算不饱和度的计算,三、结构研究中采用的主要方法,电子能级跃迁所产生的吸收光谱，主要在近紫外区和可见区，称为可见-紫外光谱；键振动能级跃迁所产生的吸收光谱，主要在中红外区，称为红外光谱；自旋的原子核在外加磁场中可吸收无线电波而引起能级的跃迁，所产生的吸收光谱称为核磁共振谱。,吸收光谱的一般原理,（一）紫外-可见吸收光谱（UV-vis）,（二）、红外光谱（IR谱）,（S-（-）-藏茴香酮的IR图谱（液膜法）,表 红外吸收的八个重要区段,用红外光谱法测定结构，化合物用量只需510g。如果被测定物是已知物，只要和已知对照品做一张红外光谱图，如果二者红外光谱完全一致，则可推测是同一物质。如无对照品，也可检索有关红外光谱数据图谱文献。如果被测物结构基本已知，可能某一局部构型不同，在指纹区就会有差别，红外光谱对未知结构化合物的鉴定，主要用于功能基的确认，芳环取代类型的判断等。,（二）、红外光谱（IR谱）,（三）、核磁共振（NMR）法,核磁共振谱是化合物分子在磁场中受电磁波的辐射，有磁距的原子核（如1H、13C等）吸收一定的能量产生能级的跃迁，即发生核磁共振，以吸收峰的频率对吸收强度作图所得之图谱。它能提供分子中有关氢及碳原子的类型、数目、互相连接方式、周围化学环境、以及构型、构象的结构信息。,（三）、核磁共振谱,1、常用的氘代溶剂丙酮-d6、三氯甲烷-d、DMSO-d6等,（三）、核磁共振谱,2、1H-NMR（1）化学位移 1H核因周围化学环境不同，其外围电子云密度及绕核旋转产生的磁屏蔽效应不同，不同类型的1H核共振信号出现在不同区域，据此可以识别。,（三）、核磁共振谱,(2)峰面积：1H-NMR谱上积分面积与分子中的总质子数相当，分析图谱时，只要通过比较共振峰的面积，就可判断氢核的相对数目；当化合物分子式已知时，就可以求出每个吸收峰所代表氢核的绝对个数。,1、氢核磁共振谱（1H-NMR）,(3)峰的裂分及偶合常数（J）：磁不等同的两个或两组氢核，在一定距离内因相互自旋偶合干扰而使信号发生裂分，表现出不同裂分，如s（单峰,singlet）、d(二重峰,doublet)、t(三重峰,triplet)、q(四重峰,quartet)及m(多重峰,multiplet)等。,1、氢核磁共振谱（1H-NMR）,在低级偶合系统中，某一质子裂分后的谱线数为n+1,其中n为干扰核的数目。裂分间的距离为偶合常数(coupling constant,J，Hz)，用于表示相互干扰的强度，其大小取决于间隔键的距离。各种不同环境下1H核相邻结构具有一定的偶合常数值。间隔的键数越少，则J值越大；反之则越小。,1、氢核磁共振谱（1H-NMR）,C10H12O2的1H-NMR谱图,(苯氢),(与氧原子相连的亚甲基氢),(与羰基相连的甲基氢),图1-32-紫罗兰酮的质子非去偶谱（62.5MHz,13C-NMR,CDCl3）,2、碳核磁共振谱（13C-NMR谱）,(1)化学位移值；,RCH3 d 0 35R2 CH2 d 15 40R3 CH d 25 50连杂原子碳（C-O,C-N,C-S)d 50 100甲氧基碳（OCH3)d 55左右糖端基碳 95105 CC d 65 90C=C、芳环C d 98 160连氧芳碳 d 140 165 CO d 168 220醛190205；酮195220；羧酸170185；酯及内酯165180，酰胺及内酰胺165180,2、碳核磁共振谱（13C-NMR谱）,(2)峰高：没有提供各类碳的相对比例，没有积分曲线（峰面积不成比例）；,(3)偶合常数：1JCH120-320Hz相隔两个以上偶合在13C谱中实用价值不大；,2、碳核磁共振谱（13C-NMR谱）,噪音去偶谱也叫全氢去偶或宽带去偶,图-紫罗兰酮的噪声去偶谱（62.5MHz,13C-NMR,CDCl3）,常见的谱图,选择氢核去偶谱及远程选择氢核去偶谱,图-紫罗兰酮的9位羰基的LSPD谱(25MHz,13C-NMR,CDCl3)a.质子非去偶谱 b.照射7-H,8-H c.照射7-H,10-H d.质子噪声去偶谱 e.照射10-H f.照射8-H,10-H,常见的谱图,=45，测得图谱中，除季碳外，所有C核都有正吸收信号；=90，测得图谱中，只有(-CH)次甲基是正吸收信号；=135，测得图谱中，只有(-CH)次甲基，CH3为正吸收信号，CH2为负吸收信号；,DEPT谱：采用一种脉冲系列，通过改变照射1H核的第三脉冲宽度（）使之分别为45、90、135；,常见的谱图,DEPT（Distortion1ess enhancement by polarization transfer）,图-紫罗兰酮的DEPT谱,二维核磁共振（2D-NMR）,图 乙酸乙酯的1H-1HCOSY（360MHz，CDCl3）图谱,核Overhauser效应：当两个（组）不同类型质子位于相近的空间距离时，照射其中一个（组）质子会使另一（组）质子的信号强度增强。这种现象称为核的Overhauser效应（nuclear Overhauser effect，简称NOE）。HMQC谱：HMQC谱是通过lH核检测的异核多量子相关谱(lH detected heteronuclear multiple quantum coherence，HMQC),此谱能反映 lH核和与其直接相连的13C的关联关系，以确定C-H偶合关系（1JCH）。HMBC谱:是通过lH核检测的异核多键相关谱(lH detected heteronuclear multiple bond correlation，HMBC)，它把lH核和与其远程偶合的13C核关联起来。,二维核磁共振（2D-NMR）,（四）质谱（MS）,质谱（MS）就是把化合物分子用一定方式裂解后生成的各种离子,按其质量大小排列而成的图谱。,质荷比,离子的丰度,质谱仪,图 桂皮酸乙酯的质谱图,1.电子轰击法（Electron impact ionization，简称EI），测定EI-MS时，需要先将试样加热气化，使之进入离子化室，而后才能电离。2.FD-MS（场解析电离）：适合对热不稳定、极性大、难挥发的化合物的测定。3.FAB-MS（快速原子轰击电离）：除了给出分子量及糖的碎片信息外，在低质量区还给出了苷元的结构碎片，从而弥补了FD-MS的不足。,（四）质谱（MS）,图 Balanitin-1的FD-Ms图,图 patrinia saponin H3的阴离子FAB-MS谱,化学电离（Chemical ionization，简称CI）场致电离（Field ionization 简称FI）电喷雾电离（Electro spray ionization，简称ESI）基质辅助激光解吸/电离（MALDI）场解析（FD）,（二）质谱（MS）,旋光光谱和圆二色光谱在测定手性化合物的构型和构象、确定某些官能团(如羰基)在手性分子中的位置方面有独到之处，是其它光谱无法代替的。单晶X射线衍射技术,（五）、旋光光谱（ORD)与园二色谱（CD谱),