《多聚核苷酸与核酸》PPT课件.ppt

第 三 章多聚核苷酸与核酸Polynucleotides AND Nucleic Acids,多聚核苷酸(Polynucleotides),多聚核苷酸是核苷酸通过3，5-磷酸二酯键连接的聚合物，是核酸(nucleic acid)分子中的基本形式。,核酸的分类及分布,存在于细胞核和线粒体,分布于细胞核、细胞质、线粒体,(deoxyribonucleic acid,DNA),(ribonucleic acid,RNA),脱氧核糖核酸,核糖核酸,第一节多聚核苷酸Polynucleotides,一、多聚核苷酸就是核苷酸的多聚物,多个核苷酸（nucleitide）通过3，5-磷酸二酯键（phosphodiester bond）连接、形成的链状聚合物，即多聚核苷酸（polynucleotides）。,3,5-磷酸二酯键,（一）3,5-磷酸二酯键是核酸的基本结构键,（二）多聚核苷酸链有方向性,（三）书写方法,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,目 录,（四）核酸分为核糖核酸和脱氧核糖核酸两类,RNA是单链多聚核糖核苷酸 DNA是单链或双链多聚脱氧核糖核酸,二、多聚核苷酸链在细胞内通过复制和转录而合成,生物体内的DNA链或RNA链的合成是在包括DNA聚合酶或RNA聚合酶在内的一组酶共同参与下完成的。这个合成过程以dNTP或NTP为原料，以单链DNA链为模板，逐步地完成从5-末端到3-末端的合成。以DNA为模板合成DNA链和RNA链的过程分别称为复制（第十六章）和转录（第十七章）。,三、多聚核苷酸链可在体外经多种方式合成,（一）DNA聚合酶链反应是当前获得DNA片段最常用技术（二）单链寡脱氧核糖核苷酸链可利用亚磷酰胺三酯方法合成（三）核糖核苷酸链可利用体外转录体系合成,（一）DNA聚合酶链反应是当前获得DNA片段最常用技术,DNA聚合酶链反应（DNA polymerase chain reaction，PCR）是在体外条件下复制DNA片段的方法。将专用的DNA聚合酶（DNA polymerase）、dNTP、一对引物（primer）及模板DNA混合在一起，经过多个升温解链-降温退火-恒温延伸的循环过程，DNA聚合酶将合成出与模板完全相同的双链DNA片段。每一个循环过程都将被复制的DNA片段数目按指数增长，因此采用PCR技术获得DNA的过程，又称为体外扩增（in vitro amplification）技术，应用极广（第二十三章）。,（二）单链寡脱氧核糖核苷酸链可利用亚磷酰胺三酯方法合成,该合成通常是在DNA自动合成仪的固相载体上完成的，连接一个核苷酸需要4个步骤。然后，通过氨水高温处理将核苷酸链从固相载体上分离下来。利用DNA自动合成仪合成的寡核苷酸DNA单链一般为几十个核苷酸。值得注意的是，该方法中的合成方向是从3-末端向5-末端合成。用于基因检测的寡核苷酸探针（probe）以及用于PCR反应的引物都是利用该方法得到的。,（三）核糖核苷酸链可利用体外转录体系合成,利用体外转录体系（in vitro transcription system）合成RNA（链）是分子生物学常用技术。这种体外转录体系是现代发展起来的体外转录（in vitro transcription）技术在含有RNA聚合酶（转录酶）、必要的蛋白质因子、核苷三磷酸等条件的体外无细胞体系中，加入DNA模板，模仿体内转录、生成RNA的过程（第二十四章）。利用真核细胞核抽提物（nuclear extract）建立再造体系是当前生物技术商家提供体外转录商品试剂盒（kit）的主要来源。,四、核苷酸的排列顺序就是多聚核苷酸链的一级结构,定义多聚核苷酸链的核苷酸从5-末端到3-末端的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。,第二节DNA的结构和功能 Structure and Function of DNA,一、DNA的二级结构是右手双螺旋,（一）DNA的碱基组成遵循Chargaff法则,Chargaff 规则,不同种属生物的DNA碱基组成不同；同一个体不同器官、不同组织的DNA具有相同的碱基组成；对于一个特定的组织的DNA，其碱基组份不随其年龄、营养状态和环境而变化；腺嘌呤与胸腺嘧啶的摩尔数相等，鸟嘌呤与胞嘧啶的摩尔数相等。A=TG C,不同生物来源的DNA碱基组分的相对比例,包括5-甲基胞嘧啶 比值偏离1：1是实验误差所致,DNA是反向平行、右手螺旋的双链结构两条多聚核苷酸链相互平行但走向相反，围绕着同一个螺旋轴形成右手双螺旋结构由脱氧核糖和磷酸基团构成的亲水性骨架（backbone）位于双螺旋结构的外侧，而疏水的碱基位于内侧。直径为2 nm，螺距为3.4 nm从外观上看，DNA双螺旋结构的表面存在一个大沟（major groove）和一个小沟（minor groove）,（二）DNA二级结构是右手双螺旋（Watson,Crick,1953）,DNA双链之间具有碱基互补关系碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T;GC）相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基,DNA双链模型,碱基互补配对,T,A,G,C,疏水作用力和氢键维系DNA双螺旋结构的稳定相邻的两个碱基对平面在旋进过程中发生相互重叠（overlapping），由此产生了疏水性的碱基堆积力（base stacking interaction）。这种碱基堆积力和互补碱基对的氢键共同维系着DNA双螺旋结构的稳定，并且碱基堆积力在双螺旋结构的稳定中起着更为重要的作用。,（三）DNA双螺旋结构有多种类型,不同类型的DNA双螺旋结构,不同构象DNA的结构参数,（四）某些状态下DNA可形成多链结构,1.Hoogsteen碱基配对 形成三股螺旋DNA,H-DNA的结构,Watson-Grick和Hoogsteen DNA螺旋中碱基对间氢键的位置,2 4条多聚鸟嘌呤核苷酸链形成四螺旋DNA,二、DNA在二级结构基础上形成超螺旋结构,（一）超螺旋结构具有不同的拓扑异构体,DNA在双螺旋结构基础上通过盘绕和折叠所形成的空间构象称为三级结构。,超螺旋结构(superhelix 或supercoil)将DNA的两端固定，使之旋进过分或旋进不足，DNA双链上就会产生额外的张力而发生扭曲，以抵消张力。这种扭曲称为DNA双链的超螺旋结构。,正超螺旋(positive supercoil)旋进过分的方向与DNA双链的螺旋方向相同,负超螺旋(negative supercoil)旋进过分的方向与DNA双链的螺旋方向相反,松弛态DNA（relaxed DNA）在溶液中是以能量最低的状态存在的线性DNA。,自然条件下的DNA都是以负超螺旋的构象存在的，也就是说，DNA的实际螺旋数要少于它含有的碱基对数目应该对应的螺旋数。负超螺旋状态有利于解开DNA双链。DNA的复制、转录、组装等许多过程都需要解开双链才能进行。生物体可以通过DNA的不同超螺旋结构来控制其功能状态。,（二）原核生物DNA和线粒体DNA是环状DNA的结构,原核生物的DNA都是闭合环状的双螺旋结构。它在细胞内紧密缠绕形成了致密的小体，称为类核（nucleoid）。,线粒体和叶绿体是真核细胞中含有核外遗传物质的细胞器。线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是一个封闭的双链环状分子。人mtDNA全长16,569个碱基对，共计37个基因,分别编码13个蛋白质、2个rRNA、22个tRNA。,核小体(nucleosome)是染色质的基本组成单位，由DNA和蛋白质构成。,1双链DNA缠绕在组蛋白核心上构成核小体DNA：约200bp 组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4,（三）真核生物DNA与组蛋白组成高度有序的染色质,核小体的结构示意图,a.组蛋白八聚体核心 b.核小体 c.直径30nm纤维的剖面图显示H1的位置 d.核小体组成串珠样的染色质,a,c,b,d,2组蛋白是小分子量的碱性蛋白质,组蛋白分子质量在11kD到21kD之间，组蛋白中富含精氨酸和赖氨酸。各种真核细胞都有5种组蛋白，但分子质量和氨基酸的顺序有些差异。在所有真核生物中H3，H4组蛋白氨基酸序列高度保守，提示功能是相同的。但是各种生物的H1、H2A、H2B的相似性很少。,核小体进一步组装成染色质/染色体,1核小体组成30nm纤维,2螺线管进一步折叠、包装为染色质和染色体,三、DNA是生物遗传信息的载体,早在20世纪30年代，人们就已经知道了染色体是遗传物质，也知道了DNA是染色体的组成部分。直到Avery等人采用细菌转化实验（1944年），后经Hershey和Chase通过同位素标记噬菌体DNA感染细菌实验（1952年）才直接证明了DNA是遗传的物质基础。,（一）DNA是遗传的物质基础,DNA的遗传信息是以基因的形式存在的。基因（gene）是编码RNA或多肽的DNA片段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。DNA利用四种碱基的不同排列对生物体的所有遗传信息进行编码，经过复制遗传给子代，并通过转录和翻译确保生命活动中所需的各种RNA和蛋白质在细胞内有序合成。,（二）DNA全部核苷酸序列组成基因组,基因组（genome）就是一个生物体的全部遗传信息，即DNA的全部核苷酸序列。绝大多数生物个体的基因组是DNA，但有些病毒的基因组是RNA。,不同生物体的基因组,注：1.酵母染色体数是单倍体数，野生酵母株通常含8倍体或更多 2.除酵母外的真核生物的染色体数均为双倍体数 3.雌性线虫染色体是12条，雄性11条,DNA是生物遗传信息的载体，并为基因复制和转录提供了模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。DNA具有高度稳定性的特点，用来保持生物体系遗传的相对稳定性。同时，DNA又表现出高度复杂性的特点，它可以发生各种重组和突变，适应环境的变迁，为自然选择提供机会。,第三节 RNA的结构与功能 Structure and Function of RNA,RNA是DNA的转录产物。RNA通常以单链线性形式存在，但是可以通过链内的碱基互补配对形成局部的双螺旋结构，进而形成三级结构。与DNA相比，RNA的种类、大小、结构以及稳定性表现出了多样化，这与它们的功能多样化密切相关。,真核细胞内主要RNA的种类和功能,一、信使RNA结构含有氨基酸编码序列,内含子(intron),*mRNA成熟过程,外显子(exon),（一）mRNA 5-末端具有帽结构大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C-2也会被甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。mRNA的帽结构可以与一类称为帽结合蛋白（cap binding proteins,CBP）的分子结合。这种结合对维持mRNA的稳定性、将mRNA从细胞核转运到细胞质中、以及与核糖体以及翻译起始因子的结合等密切相关。,真核mRNA的5-末端7-甲基鸟嘌呤核苷帽状结构及核糖甲基化,（二）mRNA 3-末端具有多聚A的尾结构 大多数真核mRNA的3末端是一段有80250个腺苷酸的多聚腺苷酸结构，称为多聚A尾(poly(A)-tail)。多聚A尾在细胞内与poly(A)结合蛋白poly(A)-binding protein,PABP相结合而存在，每1020个腺苷酸结合一个PABP单体。所以，真核细胞的mRNA的3-端实际上是一个poly(A)和蛋白质多聚体形成的复合物。,mRNA核内向胞质的转移mRNA的稳定性维系翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,（三）mRNA含有氨基酸密码子mRNA的功能是转录核内编码蛋白质信息的DNA碱基排列顺序，并携带至细胞质，指导蛋白质合成。mRNA分子从5-末端的第一个AUG(起始密码子)开始，每3个核苷酸为一组，决定肽链上一个氨基酸，称为三联体密码(triplet code)或密码子(codon)。位于起始密码子和终止密码子之间的核苷酸序列称为开放阅读框(open reading frame，ORF)，可读框内的核苷酸序列决定了多肽链的氨基酸序列。,一条完整的mRNA包括5-非编码区、编码区和3-非编码区。编码区包括起始密码子、编码氨基酸的序列和终止密码子。,（一）tRNA分子含有稀有碱基 含 10%20%稀有碱基，如 DHU 3末端为 CCA-OH 5末端大多数为G 具有 TC,二、转运RNA含有接纳氨基酸和mRNA识别序列,N,N二甲基鸟嘌呤,N6-异戊烯腺嘌呤,双氢尿嘧啶,4-巯尿嘧啶,稀有碱基,tRNA中常见的稀有碱基,氨基酸臂,额外环,（二）tRNA有“三叶草”样二级结构和倒“L”形三级结构,环,氨基酸臂,DHU环,反密码环,环,氨基酸臂,DHU环,反密码环,反密码子,tRNA三级结构及氢键的位置,氨基酸臂,额外环,有些氨基酸只有一种tRNA作为载体，而另外的一些氨基酸则需要几种tRNA作为载体。,（三）tRNA有识别mRNA密码的反密码子,*tRNA的功能活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,*rRNA的结构,三、核糖体RNA与核糖体蛋白组成核糖体,*rRNA的种类（根据沉降系数）,真核生物 5S rRNA 28S rRNA5.8S rRNA 18S rRNA,原核生物 5S rRNA23S rRNA16S rRNA,（一）原核、真核rRNA分子质量不同,核糖体的组成,rRNA与核糖体蛋白质共同构成核糖体，是蛋白质生物合成的场所：为肽链合成所需要的mRNA、tRNA、多种蛋白因子提供了相互结合的位点和相互作用的空间环境。,（三）rRNA参与组成的核糖体是蛋白质翻译的场所,四、非信使小RNA具有多样性,除了上述三种RNA外，细胞内存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非信使小RNA(small non-messenger RNAs,snmRNAs)。,snmRNAs,非编码RNA(non-coding RNA)专指那些具有调节作用的小RNA，如siRNA、miRNA等。,snmRNAs的种类核内小RNA（small nuclear RNA，snRNA）核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）胞质小RNA（small cytoplasmic RNA，scRNA）催化性小RNA（small catalytic RNA）小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）微RNA（microRNA，miRNA）等,在hnRNA和rRNA的转录后加工、转运中发挥作用，有的参与基因表达调控等；是现代生物学研究的新领域。,真核细胞内重要的snmRNAs,（一）核内小RNA与核糖核蛋白结合共同参与mRNA前体加工,高等真核细胞snRNA的特征,（二）催化性小RNA参与RNA剪接加工,一些小RNA分子具有催化特定RNA降解的活性，在RNA合成后的剪接中具有重要作用。这种具有催化作用的小RNA亦被称为核酶(ribozyme)或催化性RNA(catalytic RNA)。,（三）核仁小RNA参与rRNA甲基化修饰,（四）小干扰RNA特异阻断体内同源基因的表达,第 四 节核 酸 的 理 化 性 质Chemical and Physical Properties of Nucleic Acids,核酸的酸碱及溶解度性质核酸为多元酸，具有较强的酸性。可与金属离子成盐，不溶于乙醇或异丙醇,一、核酸具备多种基本物理化学性质,核酸中的糖苷键和磷酸酯键都能被酸、碱和酶水解。,（一）核酸可被酸、碱水解,（二）核酸是两性分子,碱基可发生互变异构碱基在体液环境中以碱性解离为主核酸分子是酸性化合物,（三）核酸溶液具有高分子性质,黏滞度：DNA RNAdsDNA ssDNA沉降系数：溶液中的核酸在离心力场中可下沉。DNA分子经反复盘曲形成超螺旋后，其沉降系数增加，超螺旋松解后其沉降系数减小。,（四）核酸具有紫外线吸收特性,核酸的紫外吸收（OD260）单核苷酸 ssDNA（或RNA）dsDNA,1.DNA或RNA的定量A260=1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:A260/A280=1.8RNA纯品:A260/A280=2.0,A260的应用,二、核酸变性、复性是很多分子生物学技术操作的基础,定义：核酸的变性（denaturation）指DNA双螺旋之间的氢键断裂变成单链、或RNA局部氢键断裂变成线性单链结构的过程,方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等,变性后其它理化性质变化：,A260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失,（一）核酸变性是双链解离为单链的过程,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,（二）核酸变性时伴有增色效应,DNA的紫外吸收光谱,增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。,热变性,解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。,Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称熔解温度(melting temperature,Tm)。影响因素：1DNA均一性决定熔解温度范围大小；2G-C碱基对含量决定熔解温度高低；3介质中的离子强度影响变性。,Tm值是DNA变性的重要参数,Tm值的经验公式是：Tm=69.3+0.41（%G+C）,（三）变性的DNA可以复性,DNA复性(renaturation)的定义当变性条件缓慢地除去后，两条解离的互补单链可重新配对结合成为双螺旋结构，或恢复局部双螺旋结构。这一现象称为复性。,减色效应DNA复性时，其溶液A260降低。,热变性的DNA经缓慢冷却后才可复性，这一过程称为退火(annealing)。,（四）利用变性、复性可进行分子杂交,将不同来源的DNA混合在一起，经热变性后，让其慢慢冷却复性。若这些异源DNA之间在某些区域具有互补的序列，复性时就会形成杂化双链（heteroduplex）。这种杂化双链可以在不同的DNA单链之间形成，也可在RNA单链之间形成，甚至还可以在DNA单链和RNA单链之间形成，其前提条件是两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系。这种现象称为核酸分子杂交（hybridization）。,DNA-DNA杂交双链分子,不同来源的DNA分子,核酸分子杂交的应用（1）Southern印迹可检测DNA（2）Northern印迹用于检测RNA,此外，斑点印迹杂交(Dot blot)和DNA芯片(DNA micray)技术也是利用核酸杂交原理设计的。,三、核酸与其他分子的相互作用,从开始合成到完全降解，核酸无时无刻地与其周围环境中的分子发生各种各样的相互作用（interaction）。这些分子可以是有机小分子，也可以是生物大分子。这些相互作用可以是特异性的，也可以是非特异性的。作用方式可以是共价的，也可以是非共价的。作用部位可以是核酸的碱基，也可以是磷酸骨架或戊糖。,核酸与蛋白质的相互作用最为常见。,四、核酸的化学修饰,核酸化学修饰（chemical modification）可发生在碱基、戊糖，甚至磷酸基。构成tRNA的稀有碱基就是化学修饰的结果。最常见的碱基化学修饰是甲基化（methylation）。,DNA的磷酸骨架中还能够发生磷硫酰化修饰，从而解释了为什么硫元素结合到DNA骨架上会使之降解的奥秘。,第 五 节核酸（水解）酶 Nucleases,核酸酶(nuclease)是所有水解核酸的酶的统称。核酸酶种类多，功能多样。在细胞内，核酸酶的主要生理功能是参与DNA的损伤修复、转录后加工、核酸降解等核酸代谢过程，也是相关的分子生物学操作中常用工具酶。,（一）按底物专一性分类DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)：专一降解DNARNA酶(ribonuclease,RNase)：专一降解RNA,一、核酸酶有多种,（二）按对底物作用方式不同分类核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶核酸外切酶：53或35核酸外切酶（三）按对底物二级结构的专一性分类双链酶：作用于双链核酸单链酶：作用于单链核酸,二、核糖核酸酶是一类RNA内切酶,（一）胰核糖核酸酶识别嘧啶核苷酸（二）核糖核酸酶T1识别鸟嘌呤核苷酸（三）核糖核酸酶T2识别腺嘌呤核苷酸,3种核酸酶作用位点,三、不同脱氧核糖核酸酶有不同的作用方式和产物,（一）胰脱氧核糖核酸酶可切割单链/双链DNA（二）脾脱氧核糖核酸酶产物是3-磷酸末端的寡聚核苷酸（三）3外切酶活性是BAL 31核酸酶的主要功能（四）限制性内切核酸酶具有位点特异性,四、N-糖苷酶可移去碱基,N-糖苷酶（glycosidase）有多种，各种非特异或碱基特异的糖苷酶可以水解核苷酸的N-糖苷键，去除核苷酸的碱基。,