《基因符号》PPT课件.ppt

二、基因符号,1966年由Demerec提出大肠杆菌命名规则，在此基础上发展成为公认的基因命名规则。）每个基因座位用斜体小写的三个英文字母表示。trp（tryptophan）-色氨酸基因,str（streptomycin）-链霉素抗药性基因2)产生同一表型的不同基因，在三个字母后用大写英文字母表示trpA和trpB,3）同一基因不同突变位点，在基因符号后加阿拉伯数字。trpA23，trpA46-基因的表型和产物用三个正体英文字母表示。Ara+,Ara-.4）某些基因特征不能用一个字表示，需要几个字。则采用几个字的首字母。例如：与核糖体大蛋白亚基相关基因：rpL,rpS.-str(链霉素抗药性基因)可以写成rpsL,5）his+-组氨酸野生型；his-组氨酸缺陷型；strs-链霉素敏感野生型 strr-链霉素抗药性突变型 strd-链霉素依赖型 6）当染色体上存在缺失时，缺失部分放在后括号内。（lac,pro）表示从乳糖发酵基因到脯氨酸基因的染色体缺失.rfauvrB(深度粗糙突变性基因，缺失了自外损伤修复基因)；7）易位：T(；)，T()。,1、固体培养基中培养突变率计算方法,大肠杆菌抗性突变,一个菌落代表一次抗性突变，无论该菌分裂多少次，仍然为一个抗性菌落，突变型菌落数=突变发生次数在这种情况下，突变率计算按公式计算:突变率=M2-M1N2-N1M2、M1前后两个时间出现抗性菌落数N2、N1前后两个时间的细菌总数,考虑到细菌分裂不是同步进行的 细菌世代总数=N2-N10.69突变率=(M2-M1)0.69N2-N1,1、碱基类似物引起的诱变,碱基类似物：指分子结构上与DNA中碱基非常相似的一类化合物。在DNA复制中可替代正常碱基参入到DNA链中，引起配对错误发生诱变。,一 碱基置换,（一）化学诱变,1)碱基类似物-5-溴尿嘧啶（5-BU）与胸腺嘧啶（T)结构相似5-溴尿嘧啶（5-BU）有酮式和稀醇式（为主）两种形式5-BU可引起 ATGC GCAT（为主）5-BU使细菌突变率提高万倍。,5,5,T:酮式为主 5-BU:稀醇式为主,5-,酮式,稀醇式,正确配对复制错误两代以后还会出现,错误配对参入错误两代以后不会出现,GC-AT主要,2)碱基类似物-2-氨基嘌呤(2-AP)与腺嘌呤A相似2-AP可与T（为主）和C配对2-AP可引起ATGC（为主）GCAT,图,与A结构相似,为主,AT-GC:met 回复突变正确配对复制错误两代以后还会出现,GC-AT:arg 回复突变错误配对参入错误两代以后不会出现,3）烷化剂类,种类多：甲基磺酸乙酯（EMS）、乙基磺酸乙酯（EES）和亚硝基胍（NTG）作用：使DNA中碱基发生烷基化例如EMS使鸟嘌呤带有乙基，该鸟嘌呤不与C配对，而与T配对。引起GCAT的转换亚硝基胍（NTG）：超诱变剂，使基因突变率高达1%。引起并发突变。,图,（二）物理诱变剂的种类及作用机制,1、辐射的种类:电离辐射和非电离辐射1)电离辐射:是一切能引起物质电离的辐射总称，包括高速带电粒子有粒子、粒子、质子，不带电粒子有中子以及X射线、射线 射线是一种带电粒子流，很容易引起电离,穿透能力差.射线也是一种高速带电粒子，其电离能力比射线小，但穿透本领比射线大 X射线和射线的穿透力极强，波长短，能量大，仅一部分被物质所吸收，大部分经由原子间隙而透过，这正是X射线透视和摄影的物理基础。,2)非电离辐射：,是指波长大于100 纳米的电磁波，由于其能量低，不能引起水和组织电离，故称为非电离辐射。非电离辐射包括光和电磁辐射。光包括可见光、红外线、紫外线电磁辐射包括超声波：频率比人的听频范围高的声波就叫做超声波（高于20000Hz）。超声波的频率高，相对较少出现绕射现象，所以回声十分清晰。超声波扫描不涉及有害的辐射，远比 X-射线等检验工具安全。,2、辐射的生物学效应,DNA经过辐射处理通常发生以下变化:碱基受损，发生开环、脱氨和过氧化脱氧核糖分子C-C断裂或-OH氧化单核苷酸分解，释放出磷酸酯和碱基DNA 分子断裂,形成胸腺嘧啶二聚体DNA 分子交联,胸腺嘧啶二聚体,1)电离辐射作用,直接作用 指射线直接作用于DNA分子，通过电离和激发使DNA受到损伤。间接作用 指射线与DNA周围其它原子或分子特别是水分子作用，产生具有很高活性的自由基（如OH，H和eaq-）进而损伤DNA。,碱基变化 脱氧核糖变化DNA链断裂 单链断裂（SSB）双链断裂（DSB）交联 DNA链交联 DNA-蛋白质交联 其中DSB是辐射所致生物学效应中最重要的原初损伤.,电离辐射致DNA分子的变化,二、嵌合剂和移码突变,移码突变：DNA分子中一对或少数几对核苷酸的增加或缺失，造成该位置后面的密码意义全部发生错误（三对除外）。,ATGAAAGAG.,ATGGAG.,Deletions,One or more base pairs are lost,Possible results a.amino acids or polypeptides can be lost b.frameshifts can occur(see below),TB,二 DNA损伤、修复,1 DNA损伤：DNA双螺旋结构发生的任何改变。可以分为两类：单个碱基改变和结构扭曲。2 自发性损伤、化学因素、物理因素3 DNA修复：为了保证遗传信息的高度稳定性，生物细胞在进化过程中形成了一系列多步骤的修复机制。,（一）光修复,这是最早发现的DNA修复方式。修复是由细菌中的DNA光解酶（photolyase）完成，此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光；结合后如受300-600nm波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从DNA链上释放，DNA恢复正常结构。此酶广泛存在，但人体只存在于淋巴细胞和皮肤成纤维细胞，且是次要修复方式。,1）细胞内有多种特异的核酸内切酶，可识别DNA的损伤部位，在其附近将DNA单链切开，再由外切酶将损伤链切除，由聚合酶以完整链为模板进行修复合成，最后有连接酶封口。uvrA,uvrB,uvrC:编码内切核酸酶 2）碱基脱氨形成的尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤可被专一的N-糖苷酶切除，然后用AP核酸内切酶打开磷酸二酯键，进行切除修复。,（二）切除修复,-“复制后修复”（post-replication repair）因为它们在复制后起作用，也称为“重组修复”（recombination-repair）。此系统在处理复制含有损伤碱基模板后产生的子代二倍体的缺陷中起作用重组酶：recA,recB,recC(染色体交换)-重组修复中原损伤没有除去，但若干代后可逐渐稀释，消除其影响。所需要的酶包括与重组及修复合成有关的酶，如重组蛋白A、B、C及DNA聚合酶、连接酶等,（三）重组修复,（四）SOS系统许多损伤DNA或抑制大肠杆菌复制的手段引起一系列综合的表现型改变，称为SOS反应。这是由RecA蛋白和LexA抑制物相互作用而引起的。SOS反应表现为修复损伤DNA的能力增强,这是通过诱导修复系统和RecA重组修复系统组分的合成来实现的。,Insertions,ATGAAAGAG.,ATGGAG.,Possible results a.amino acids or polypeptides can be gained.b.frameshifts can occur(see below),One or more base pairs are gained,TB,嵌合剂引起移码突变：,ICR191,5-氨基吖啶，吖啶橙，原黄素.为平面三环化合物，可插入二个碱基对中间，使得原来的相邻的碱基相互分离，这种DNA分子在复制过程中很容易插入1-2 个碱基，从而引起移码突变。,吖啶橙插入到两对碱基之间,Frameshift mutations(移码突变),ATGCAAGTTG.,one base pair deletion,Insertions or deletions that change the translational frame,Two changes in polypeptides are possible:(1)every amino acid downstream of the mutation is changed,(2)a truncated(shortened)protein is produced.,TB,野生型DNA,部分单链消失,突环形成,修补合成,CA错配的产生,营养缺陷型诱变筛选步骤及方法,营养缺陷型浓缩营养缺陷型检出营养缺陷型鉴定,1营养缺陷型浓缩,1）抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。-由于野生细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。,抗生素法原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。方法：将菌培养在含抗生素的MM基中,原养型,营养缺陷型,2）菌丝过滤法：,-适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。-其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。,菌丝过滤法,适用于：丝状（放线菌、霉菌）原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。,3）差别杀菌：芽孢杆菌，80/15min;酵母菌：58/4min4）饥饿法：胸腺嘧啶缺陷-氨基酸缺陷,2 营养缺陷型检出,原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。具体方法：影印法、点种法、夹层法,逐个检出法,把经诱变处理的细胞群涂布在完全培养基的琼脂平板上，待长成单个菌落后，用接种针或灭过菌的牙签把这些单个菌落逐个整齐地分别接种到基本培养基平板和另一完全培养基平板上，使两个平板上的菌落位置严格对应。经培养后，如果在完全培养基平板的某一部位上长出菌落，而在基本培养基的相应位置上却不长，说明此乃营养缺陷型。,逐个检出法：,完全培养基,影印平板培养法,将诱变剂处理后的细胞群涂布在一完全培养基平板上，经培养长出许多菌落。用特殊工具“印章”把此平板上的全部菌落转印到另一基本培养基平板上。经培养后，比较前后两个平板上长出的菌落。如果发现在前一培养基平板上的某一部位长有菌落，而在后一平板上的相应部位却呈空白，说明这就是一个营养缺陷型突变株。,影印平板培养法,夹层培养法,先在培养皿底部倒一薄层不含菌的基本培养基，待凝，添加一层混有经诱变剂处理菌液的基本培养基，其上再浇一薄层不含菌的基本培养基，经培养后，对首次出现的菌落用记号笔一一标在皿底。然后再加一层完全培养基，培养后新出现的小菌落多数都是营养缺陷型突变株,夹层培养法,3营养缺陷型鉴定,可借生长谱法进行。生长谱法是指在混有供试菌的平板表面点加微量营养物，视某营养物的周围有否长菌来确定该供试菌的营养要求的一种快速、直观的方法。用此法鉴定营养缺陷型的操作是：把生长在完全培养液里的营养缺陷型细胞经离心和无菌水清洗后，配成适当浓度的悬液（如107108个ml），,取0.1ml营养缺陷型细胞悬液与基本培养基均匀混合后，倾注在培养皿内，待凝固、表面干燥后，在皿背划几个区然后在平板上按区加上微量待鉴定缺陷型所需的营养物粉末（用滤纸片法也可），例如氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶碱基等。经培养后，如发现某一营养物的周围有生长圈，就说明此菌就是该营养物的缺陷型突变株。用类似方法还可测定双重或多重营养缺陷型。,生长谱法方法简便；回变和污染不影响 结果 测定物质可为粉末 或纸片,缺陷型的鉴定：,测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；,鉴定营养缺陷型,含营养缺陷型菌株的基本培养基平板的制备。营养缺陷型营养类别的鉴定。缺陷型菌株单一营养因素的鉴定。,第八节 诱变选育,一 诱变处理,1 一般采用生理状态一致（用选择法或诱导法使微生物同步生长）的单细胞或孢子进行诱变处理。所处理的细胞必须是均匀而分散的单细胞悬液。分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。由于某些微生物细胞是多核的，即使处理其单细胞，也会出现不纯的菌落。因此用于诱变育种的细胞应尽量选用单核细胞，如霉菌或放线菌的孢子或细菌的芽孢,2 细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响。细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。在实际工作中，要得到均匀分散的细胞悬液，通常可用无菌的玻璃珠来打散成团的细胞，一般处理真菌的孢子或酵母细胞时，其悬浮液的浓度大约为106个/ml，细菌和放线菌孢子的浓度大约为108个/ml。,2 剂量的选择受处理条件、菌种情况、诱变剂的种类等多种因素的影响。剂量一般指强度与作用时间的乘积。要确定一个合适的剂量，通常要进行多次试验。在实际工作中，突变率往往随剂量的增高而提高，但达到一定程度后，再提高剂量反而会使突变率下降。,根据对紫外线、X射线和乙烯亚胺等诱变效应的研究结果，发现正变较多地出现在偏低的剂量中，而负变则较多地出现于偏高的剂量中，还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，更容易出现负变。因此，在诱变育种工作中，目前比较倾向于采用较低的剂量。例如，过去在用紫外线作诱变剂时，常采用杀菌率为99的剂量，而近年来则倾向于采用杀菌率为30%75%的剂量。,3 中间培养,让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。,筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.,二 高产菌株筛选,初筛一般通过平板稀释法获得单个菌落，然后对各个菌落进行有关性状的初步测定，从中选出具有优良性状的菌落。例如，对抗生素产生菌来说，选出抑菌圈大的菌落；对于蛋白酶产生菌来说，选出透明圈大的菌落。此法快速、简便，结果直观性强。缺点是培养皿的培养条件与三角瓶、发酵罐的培养条件相差大，两者结果常不一致。复筛指对初筛出的菌株的有关性状作精确的定量测定。一般要在摇瓶或台式发酵罐中进行培养，经过精细的分析测定，得出准确的数据。,变异菌株的初步筛选,透明圈法,琼脂块培养法,