《基因操作原》PPT课件.ppt

第二章 基因操作的主要技术原理,核酸的凝胶电泳扩增原理分子杂交测序,核酸的凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。,基本原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。,电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快,凝胶电泳的分辨力：与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.250Kb之间;聚丙烯酰胺的分辨力在11000bp之间,琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。,LMP琼脂糖 熔点：6265 熔解后，在37 可保持液态数小时；在25 可保持液态约10min,回收DNA分子 在65 下将LMP琼脂糖凝胶熔化；加入过量的酚抽提DNA；离心获得含DNA分子的上清液；直接酶切,琼脂糖凝胶电泳的参数：缓冲液：1 TAE（TBE TPE）凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：1g，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间 染色和观察：溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。能看到0.05 g的微量DNADNA的片断大小与荧光强度成正比,Separation Range Vs.%Agarose,Low Geling Agarose,用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算,Sample Well 25 ng 1 kb ladder0.8%Agarose,1,2,4,6,8,10,12,kb,Agarose Gel ElectrophoresisEtBr Detection Limit:5-10 ng DNA,根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小,Agarose gel electrophoresis,Agarose gel electrophoresis,聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液：TBE凝胶聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/亚甲双丙稀酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵（10）。,PolyAcrylamide Gels,脉冲电场凝胶电泳（PFGE）1984年，发明的。分离超大分子量的DNA分子。在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。,在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。107bp的DNA大分子。,PFGE can resolve large DNA fragments,基因扩增（gene amplification）主要内容：1.体外扩增 2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿主细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩增。4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增,PCR技术 在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家发明的。PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。,Reaction Condition for a Typical PCR Assay,Typical PCR Thermal Profile,*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any“unfinished”product from previous amplification to achieve its full length,Some DNA Polymerases Used in PCR,Characteristics of Taq Polymerase,PCR引物：与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。1.其长度通常在1530个核苷酸之间。2.简并引物 atggctant 3.嵌套引物 PCR扩增的长度：2kb,PCR技术的应用：1.基因组克隆 突变体的鉴定和在PCR过程中有目的的添加核算序列。,反相PCR(reverse PCR)与染色体步移,不对称PCR(asymmertric PCR)用来制备单链的DNA 特点：两种引物的浓度不同，低浓度的限制引物和高浓度引物，两者浓度相差约100倍。获得单链核苷酸的另一种方法是通过固相支持物作DAN链的特意洗脱。（生物素链霉素包裹的磁珠）,RTPCR:在mRNA反转录之后进行的PCR 检测RNA分子；获取测序模板DNA；克隆mRNA之cDNA拷贝。,基因的体外诱变,基因组的比较研究：10个碱基作引物 用随机引物扩增出的PCR产物，经琼脂糖电泳后所呈现的带型，反映着用作模板的DNA分子的总体结构特征。,核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技术 核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。,杂种核酸分子：彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。DNA/DNA的杂交作用 检测特定生物有机体之间的亲源关系 DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。,核酸杂交常用几种膜的性能比较,硝酸纤维素膜 不能滞留小于150bp的DNA片断，不能同RNA结合。应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片断DNA的滞留能力。RNA变性后也能十分容易的结合到膜上。,尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤：1.核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用 2.印迹杂交：将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNA进行杂交。,1、萨瑟恩DNA印迹杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。,印迹转移前的凝胶处理：分子量不同所需转移的时间不同；浸泡在0.25M的HCL溶液中脱嘌呤，再进行碱变性 碱水解，DNA链断裂 单链,Southern 凝胶转移杂交技术,Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片 水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。,在进行核酸印迹转移的时，1.要将以转好的硝酸纤维素膜在80度下烘烤12小时；2.紫外线交联法，将DNA分子上的部分胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面的带正电荷的氨基基团之间进行交联。,2、诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。,3、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂交（slot blotting）是在Southern印迹杂交的基础上发展的量种类式的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。,通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上。,4、菌落杂交 也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。鉴定重组子。,检测重组体克隆的菌落杂交技术,蛋白质/DNA、蛋白质/RNA杂交技术,凝胶阻滞实验（Gel retardation assay）又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。原理：DNA与蛋白的结合导致了电泳时迁移率的降低。,不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在与某一特定DNA片断结合的蛋白质分子而且可以研究发生此中结合之精确的DNA序列的特异性。（加入超量的非标记竞争DNA）,可以间接的阐明体内发生DNA与蛋白质之间的相互作用。1.用具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，可检测蛋白是否属于此类转录因子 2.在竞争DNA的已知转录因子结合位点上，引入突变可评估突变对竞争DNA性能及其转录因子结合的影响。,凝胶阻滞实验能揭示在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用的有关信息，但无法确定两者结合的准确部位。而DNase足迹实验可以解决这个问题,DNase足迹实验（footprinting assay）是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。,32p,1 5 10,*,1 4 8 10,*,加入蛋白质X,加入DNaseI凝胶电泳放射自显影,1,5,10,A B,足迹,(a),(c),(b),DNaseI 足迹实验,如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。,硫酸二甲酯（DMS）足迹实验：DMS能使裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶会对甲基化的G残基作特异的化学切割。而与蛋白结合的DNA片断上的G残基，不会被DMS甲基化，从而避开了六氢吡啶的切割作用。于是在DNA片断的序列中，不存在具这些G残基末端的DNA片断，出现了空白区。,甲基化干扰实验（methyltion interference assay）,根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。DMS化学干扰的主要局限性是，它只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。具体操作如下页图所示。,甲基化干扰实验,应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验,DNA核苷酸序列分析,传统的DNA序列分析法：Sanger双脱氧链终止法和 Maxam-Gilbert化学分析法 新发展的DNA杂交测序法,Sanger双脱氧链终止法原理：双脱氧链终止法要求使用一种单链的DNA模板和一种适当的DNA合成引物。利用DNA聚合酶的两种酶催化反应的特性：第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA为模板，合成出准确的DNA互补链；第二，DNA聚合酶能够利用2，3-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之参入到寡核苷酸链的3-末端，从而终止DNA链的延长。,影响因素：dNTP/ddNTP=1:100，DNA的谱带分离效果较佳。可读出200个以上的核苷酸顺序。降低ddNTP与dNTP的比例，就会产生出逐渐加长的片段产物，用聚丙烯酰胺凝胶分离，可读出300个左右的核苷酸顺序。,必须用限制性内切酶把高分子量的DNA分子消化为合适的片断，经电泳分离纯化后，才能用来序列分析。采用分子克隆的方法，即将酶切消化的片断随机的连接到一种适合的载体上。引物（通用引物）是载体上的一段序列，它能特异性的同载体分子上克隆位点相连的单链DNA区段杂交。,Sanger双脱氧-M13体系 M13是噬菌体载体，可以得到单链的DNA序列。Sanger双脱氧-pUC体系pUC是一种质粒载体，利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法。,Maxam-Gilbert化学分析法1977年由美国大学A.M.Maxam和W.Gilbertf发明。原理：用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片断，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影之后，便可根据x光底片上所显示的相应谱带，直接读出待测DNA片断的核苷酸序列。,由于这种化学切割反应的特异性是由碱基的修饰作用决定的，所以切割反应必定是定量的。化学切割反应的试剂：肼（hydrazine）硫酸二甲酯（dimethylsulphate）,肼：又叫联氨（NH2.NH2），在碱性条件下，与胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）作用。再通过六氢吡啶的作用，使两个磷酸分子从糖片断上释放出来，从而导致在核苷酸位置上发生DNA的断裂。,盐存在的条件下，联氨同胸腺嘧啶（T）的反应便会被抑制，最终只发生胞嘧啶碱基特异的切割反应。由此来区别C和C+T这两种化学反应。,硫酸二甲酯（(CH3O)2SO4）一种碱性的化学试剂。在它的作用下，DNA碱基环中的氮原子会发生甲基化反应，在中性的PH值环境中，可导致配糖键发生水解，使去碱基的糖-磷酸键十分微弱，在碱性条件下磷酸分子就能从DNA链上脱落，造成链的断裂。鸟嘌呤（G）的N7腺嘌呤(A)的N3 410倍,在六氢吡啶的作用下，从脱氧核糖上移去2个磷酸分子，使DNA链在甲基化的鸟嘌呤G位点断裂。,CS载体系统：末端标记载体 核酸内切酶Th111 特点：1.产生5单碱基的突出末端，便于标记；2.Th111 位点十分稀少；3.5突出末端可以是G或A，也可以是T 或C，选择性强；4.在载体中具有两个Th111 位点，可对克隆在载体上的片断任何一段作选择性标记。,化学修饰法的优点：1.不需要体外酶切；2.只要有末端标记，无论单双链都可用来测序。250个bp 限制因素：测序胶的分辨率,DNA测序分析的自动化 用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作荧光剂，预先标记M13引物DNA5-末端，按标准的双脱氧链终止法同引物进行反应，用聚丙烯酰胺电泳分析。在电泳过程中，用激光激发电泳的片断产生荧光，被荧光感受器接受，最终转换成电信号，被计算机读出，或打印出来,DNA杂交测序（sequence by hybridization）SBH 原理：如果一段短的DNA探针能够与较长的靶DNA片断杂交，并形成完全的双链体分子，那么我们便可以根据此来推断在靶DNA序列长存在着相应的互补序列。,步骤：1.将待测的靶DNA分子与一组已知核苷酸序列的寡核苷酸探针进行杂交 2.对能与待测DNA杂交的探针之间的碱基重叠关系作比较分析，据此推算靶DNA的核苷酸序列。,两种操作方式：1.将不同的寡核苷酸与固定在滤膜上的靶DNA序列样品进行杂交 2.应用寡核苷酸矩阵芯片的DNA杂交测序法,杂交的检测：磷光成像仪和图象分析软件 错配的碱基会导致杂交信号强度下降。6mer 500bp 7mer 2000bp 8mer 8000bp,SBH的应用：1.检测靶DNA的单碱基突变 2.用于不同片断之间的序列比较分析（同源性序列检测）3.用表达序列标签（EST）的矩阵芯片，检测不同类型细胞中或不同生长发育状态下的细胞中特定基因的表达状况。4.检测传统的测序技术所得DNA片断的核苷酸序列数据。,