《基因工程酶》PPT课件.ppt

基 因 工 程工 具 酶,基因工程工具酶,自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。,随着越来越多的酶分子被发现，许多厂商已将其克隆并开发成产品，工具酶的数量和用途不断增加，不仅简化了分子克隆的操作，而且拓宽了研究领域。本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。,基因工程工具酶,限制性内切酶 甲基化酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 磷酸激酶和磷酸酶 核酸酶 DNA连接酶,限制性核酸内切酶(restriction enzyme),细菌的限制修饰作用和限制性内切酶的发现,限制性内切酶的分类,限制性内切酶的命名,限制性内切酶的活性单位,限制性内切酶的性质及切割特点,限制性内切酶的反应条件,限制性内切酶的应用,细菌的限制修饰作用和限制性内切酶的发现,1、细胞的限制修饰作用,50年代后Luria和Human(1952)Bertani和Weigle(1953)发现细菌的“限制”现象：,Phage（k）,感染,E.coli k,不感染,E.coli B【E.coli B 限制（k）】,仍有少量(K)可在 E.coli B中生存，是因 E.coli B对(K)进行了修饰。,E.coli B,修饰,(k)*,(k),感染,E.coli(B),细菌如何对噬菌体进行限制和修饰。,2、细菌的限制修饰系统,1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在Phage入的DNA上。,1965年，Arber发现修饰与的降解有关，提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制修饰系统。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。,3、限制性内切酶的发现,1968年Linn和Arber从E.coli B中发现限制酶,M.Meselson和R.yuan从E.coli K中分离到另一限制性的内切酶。,1970年Smith(美)在流感嗜血杆菌又发现另一限制酶即限制酶。,限制酶的功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。,1978年W.Arber、H.O.Smith(美)，Nathans(美)因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金。,限制性内切酶的分类：目前已发现的限制酶有三大类：,限制性内切酶的命名,EcoR I,Escherichia,属名,Coli,种类,Ry13,株系,编号,若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。,限制性内切酶的活性单位,50l Buffer中，含1g底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1g DNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。（buffer：pH=8.0，50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgCl2，1mmol/L DTT或巯基乙醇，100g BSA/ml）,限制性内切酶的性质及切割特点,1、裂解产物均具有3羟基和5磷酸残基，5P-N NNNNN-OH 3。,2、识别序列及切点的高度专一。,3、有三种不同裂解方式：,a.平齐未端,环形DNA:,如 Hind、Hpa、Sma、Alu、Hae。,b.5粘性末端,5G 5A A T T C 3 3C T T A A 5 G 5,如Ecol,c.3粘性末端,如 Pst,5 C T G C A G 3 3 G A C G T C 5,限制性内切酶的反应条件,1、底物 DNA,a.DNA 纯度:RNA 与 E 结合影响有效酶浓度；RNA影响(干扰)电泳区带。,b.DNA浓度:DNA过大，会抑制酶活(影响酶分子扩散)。,如：4g DNA/1U HPa 50l 在37下 15h,而 1g DNA/1U HPa 50l 在37下 1h,c.识别位点及邻近位点特异性序列,由于切点邻近序列不同，水解速度不同。如：DNA有5个ECORI切点，其中两个相差10倍。,pBR322 DNA 有4个Nar切点(GGCGCC)其中2个切点用1U酶水解1h完全切开,2个切点用50U酶水解16h水解不完全。,Xma切点是CGGCCG，但在GGCGGCCGCC时不切割,d.DNA二级/三级结构,超螺旋DNA(病毒或质粒)比线状DNA需更多酶。,e.提取时混入杂质可改变识别特异性,如：高浓度Hg2+、酚，氯仿、乙醇、EDTA SDS、NaCl等。,2、反应系统因素,a.缓冲液（无菌、无污染、配成核心缓冲液，即几种酶的相近buffer）,b.金属离子,如型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+（如Hind，ECORI）则特异性改变。,离子浓度，合适激发酶活；不合适抑制酶活。,c.牛血清蛋白(BSA),BSA 是酶稳定剂，机制：减少蛋白酶及非特异性吸附作用。避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量BSA会引起电泳拖尾。可通过加SDS/65/5min除去。,e.水质：无离子水，ddH2O，双蒸水。,3、星活性,识别特异性放宽，如GAATTCAATT，为ECORI。,造成星活性参数：,甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二介阳离子，12%乙醇。,星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。,限制性内切酶的应用,1、重组DNA前的切割,2、构建新质粒,3、构建物理图谱,4、DNA分子杂交 用限制性内切酶消化受体DNA,5、制备DNA探针,6、亚克隆以用作序列分析,7、基因定位，DNA同源性研究。,1、大多数 E.coli 中含有两种可甲基化DNA的酶,dam 甲基化酶,Dcm 甲基化酶,dam 可将甲基引入 GATC 序列中的腺嘌呤N6位。,dcm 甲基化酶可将甲基引入 CCA/TGG 序列中的胞嘧啶残基甲基化。,2、制备细菌DNA时，应注意DNA在原细胞中的被修饰，选用无限制系统细菌(E.coli)或选用甲基化不敏感的同裂酶。,甲基化酶,3、用甲基化酶进行甲基化,a.对大多数型限制酶来说，都已分离出相应的甲基化酶(methylase)。,b.甲基化酶也称修饰酶(modification enzyme)已做为一种商品广泛应用。,c.甲基化酶的用途,1)保护某些切点不被切割；,2)配合连接子的使用，建立DNA片段粘性末端；,DPNI是唯一识别GAm6TC的限制酶，而不降解GATC。,M.Taq1可使,TCGA,甲基化,TCGAm6,TCGA+TCGA,或DNA中的 TCGATCGA序列。,连接酶,TCGATCGA,M.Taql,TCGAm6TCGAm6,DPNI切点,4)封闭DNA链中某些识别位点，交叉保护通过修饰封闭多余的限制性切点。,如：一段DNA有二个BamHI识别位点，其中一个BamHI与修饰位点重叠 可通过修饰将此位点封闭。,3)构建新的酶切位点 如：,DNA聚合酶：指在DNA(或RNA)模板指导下，以4种dNTP为底物，在引物3 OH末端聚合DNA链的一类酶。,特点：,需模板(DNA或RNA)；,需引物；,聚合方向53；,同时具有35和外切53外切作用。,DNA聚合酶,种类：,目前已发现的和已开发的此类酶有以下几种：,DNA聚合酶(全酶)(E.coli),Klenow片段(E.coli),TDNA聚合酶(TPhage感染的E.coli),TDNA聚合酶(TPhage感染的E.coli),修饰的TDNA聚合酶(测序酶),TaqDNA聚合酶(耐热)(Thermusaqraticus),DNA末端转移酶(小牛胸腺),反转录酶(依赖RNA)聚合酶,-为依赖DNA的DNA聚合酶,为不依赖DNA的DNA聚合酶。,为依赖RNA的DNA聚合酶。,活性与用途,1、DNA聚合酶,来源：E.coli，由染色体DNA基因编码。商品上用的此酶来源于Phage NM964整合的溶源性E.coli。,结构：一条多肽链，MW=109，000 D。,活性：聚合，5和 5外切。,2.klenow(E.coli),来源：E.coli DNA Polymerase经蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.1970),DNApolymerasel,枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶,C 端76，000 dKlenow活性 聚合 5外切,N 端36，000 5外切,Jacobsen(1974),Joyce 和 Grindley,(1983)克隆此大片段。,用途：填补限制酶的5-粘性末端为平齐末端：,C C G G A A T T,C C T T A A G G A A T T,末端标记,a.平齐末端中用（-32p)dNTP,底物可标记 末端,b.对于粘性末端,A A TT C C G G,A A G G C C T T C C G G,Klenow 在无底物时只进行 外切；有底物存在时则聚合。,以上也称作交换标记，但此作用不如T4DNA聚合酶。,在cDNA克隆中合成cDNA第二链。,DNA测序末端终止法(Sanger 1977),通过35外切，平齐限制酶切产生的3粘性末端(现在多用TDNA polymersase),最早用于PCR聚合反应，现已用Taq酶取代。,3、T4DNA聚合酶,来源：,T4Phage感染的E.coli,结构：,MW=114000d,活性：,53聚合反应；,用途：,填补或标记限制酶切后产生的5-粘性末端的3-凹缺末端。,补齐或末端标记，同于Klenow,3-粘性末端的标记制备DNA探针,同 Klenow 末端标记b。,35外切活性对单链活性大于双链DNA，外切酶活性比Klenow大200倍。,延伸结合于单链DNA模板上的诱变寡核苷酸引物。,4、T7DNA聚合酶（测序酶）,来源：,T7Phage感染的E.coli,结构：,由2个蛋白亚基组成：a.T7phage gene5蛋白、外切 35末端,b.宿主硫氧蛋白,活性：,53聚合，在所有DNA聚合酶中持续反应时间最长，所以合成 的DNA链长。故在DNA测序中有很大优越性,35外切活力(TPhage gene5编码)是DNA 聚合酶I的 1000倍。,用途：,复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列,用填补或交换反应快速进行末端标记。,与TDNApol一样，平齐粘性末端。,定点突变中互补链的合成。,5、修饰的 T7DNA 聚合酶(测序酶),来源：,天然 TDNAPolymerase 经修饰处理。,结构：,同T聚合酶，用还原剂、分子氧、低浓度 Fe与酶保温几天，可使PhageT7 gene5蛋白N-端35外切酶活性中心失活(O-修饰)。,即：53聚合酶作用提高，持续性长。3 5外切作用下降99%以上。,已用基因工程方法生产出改进的测序酶2.0其已完全无外切酶活性。,用途：,DNA序列分析，可读出较长的序列。,聚合能力高，可有效地将低水平dNTP(0.1mol/L)掺入到被标记底物中。,填补末端标记5-粘性末端的3端。,6、Taq DNA 聚合酶(Thermusaqraticus),来源：,从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。,结构：,单亚基MW=94000d。,活性：,聚合最适温度为75-80，不具35外切酶活性，具53外切。,用途：,PCR反应；,测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。,7、末端转移酶(不依赖模板的DNA聚合酶),来源：,是一种只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的DNA聚合酶(Chang和Bollum,1986)。,结构：,MW=60，000d.,活性：,催化dNTP掺入DNA 3-羟末端，形成同聚物末端,反应不需模板DNA，需Co2+。,用途：,克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。,末端标记,8、反转录酶,来源：商品反转录酶有两种,来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)。,来自能表达Moloney鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶基因的E.coli。,结构和活性：,合成长cDNA M-MLV优于AMV.均无35核酸外切酶活性。,用途：,合成cDNA克隆至载体中；,粘性末端补平、标记；,双脱氧测序时，如用其它酶效果不好，可使用反转录酶。,RNA 聚合酶,1、RNA聚合酶,来源：商品酶为,T7、T3RNA 聚合酶在E.coli中的克隆表达。,T7、T3、RNA 聚合酶在酵母中的克隆表达。,E.coli RNA聚合酶。,酶活：,DNA指导下的RNA合成，结合于启动子部位。转录无意义链(一)产生与有意义链相似(以U代替模板中T)的链。,转录链为无意义链，负链(-)。,不转录链为有意义链，正链(+),2、多聚(A)聚合酶(E.coli),结构：,MW=58000，一条多肽链。,活性：,催化RNA 3末端加AMP。,用途：,在RNA 3末端加Poly(A)，以合成cDNA(Gethin等.1980)。,用32PATP标记RNA 3末端。,3、鸟苷酸转移酶(Guanylytransferase),来源：,牛痘病毒。,活性：,催化GTP转移GMP至5PPPRNA的 5末端。,5PPP-RNA+GTP 或5PPRNA。,。,ppi,G5PPP5NRNA,用途：,体外转录RNA产物加帽。,磷酸激酶和磷酸酶,磷酸激酶和磷酸酶分别催化核酸 5-OH 加 P 和去除 5-P：,5p A T T A G C C C G T A A T C G G G C p 5,5HO A T T A G C C C G T A A T C G G G C OH 5,多核苷酸激酶,磷酸甲酯酶Phosphomonoesterase,应用：,标记 5-末端。,基因重组中，酶切后先去掉5P，以防止自身重组(连接)，以提 高重组效率。,重组前磷酸化。,商品酶：,T4多核苷酸激酶T4Polynucleotide kinase,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase),牛肠碱性磷酸酶(BAP),大肠杆菌磷酸酶(ClP),核酸酶,外切核酸酶,内切核酸酶,核糖核酸酶,外切核酸酶,单链 5 3和 3 5外切核酸酶。,外切核酸酶(exov)。,NMP,应用：,基因组DNA中内含子的位置作图。,切除通过Poly(dA-dT)加尾插入到质粒载体中的DNA片段。,双链5 3末端外切酶,1.入Phage外切核酸酶(入exo),降解 5-P的核苷酸，不降解 5-OH核苷酸。如降解 PNNNN,不降解 HONNN,应用：,在双脱氧测序时，将dsDNAssDNA。,平齐5-粘性末端，便于末端转移酶加尾。,2.T7 基因6外切核酸酶,应用：,降解5-P DNA末端，也可降解5-OH末端,与其它酶一起使DNA链变短。,双链35外切酶,外切核酸酶(exo),NMP,应用：,制备链特异性探针。,制备SSDNA用于双脱氧测序做为模板。,内切核酸酶,Bal 核酸酶,同时具有内切酶活性的外切酶，也可降解RNA。既具有单链特异性，同时具有 双链特异性。Bal31 活性需Ca2+，也需Mg2+，反应液中加入EDTA，便可终止Ca2+活性，而不改变Mg2+浓度，所以在终止Bal31下不影响限制性酶活性。,dNMP 或 rNMP,S1 核酸酶,对 SSDNA 有高度特异性。,绿豆核酸酶与S1类似,DNase,1、来源：,牛胰,2、结构：,MW=37KD 为-糖蛋白,3、活性：,水解位点：优先水解嘧啶5P与一个核苷核的磷酸二酯键位点。,A P G P C P T P C P G P T P A OH,Mg2+存在下，随机切割DNA双链中的任一条。Mn2+存在时，切割双链。,无RNase活性的DNase处理：,DNase/0.1mol碘乙酸，0.15mol乙酸钠(pH5.3)55加热40min，+1molCaCl2至5mmol。,4、用途：,切口平移时切口产生。,裂解双链DNA(Mn2+）。,核糖核酸酶,RNaseA,1、来源：,牛胰,2、活性：,RNA内切酶,无DNase的Rnase处理：,用TE(Tris-HCl)溶解后(1mg/ml)煮沸10-30min，分小份存20。,3、应用：,抑制：,人类胚胎特异性抑制剂 Rnasin，钒氧核苷酸复合物。用蛋白酶处理可除去RNaseA。,在制备DNA中除去RNA。,RNA测序。,除去DNA-RNA杂交链中的RNA。,RNase H,来源：,E.coli,活性：,RNA 内切酶降解 RNA-DNA 杂交链中的 RNA 链。,应用：,降解RNA-DNA中的mRNA，利于cDNA第二链合成。,RAase T1,来源：,米曲霉,活性：,内切酶，特异降解G残基后的-磷酸二酯键。,应用：,RNA 测序,中间产物无环化的单核苷酸。,连接酶,T4DNA连接酶,连接DNA末端，可连接平齐末端，所需酶是粘性末端连接的10-100倍。,酶活单位用Weiss,1Weiss单位=60个粘性末端单位,E.coli连接酶,活性：,与 T4DNA 连接酶同，但不连接平齐末端。在非平端连接时，可代替 T4DNALigase。,酶活单位用Modrich-lehman,1Modrich-lehman=6个Weiss,RNA 连接酶,T4RNA 连接酶,活性：,在ATP存在下，可催化单链DNA或RNA连接。,应用：,RNA3末端放射性标记。,增加 T4DNA ligase 的平端连接活性。,