《基因引物设计》PPT课件.ppt

常用实验技术简介,黄雪娜2011-8-4,目 录,全长cDNA克隆引物设计染色体步移技术,全长cDNA克隆,是许多后续更深入实验的基础；真核生物mRNA的特征及转录过程的了解；全长cDNA克隆方法：灵活掌握；同源克隆技术RACE-PCR技术,基因克隆前的准备工作,看有没有被别人克隆出来；查看文献了解基因的功能及表达特征；了解该基因可能涉及的工作（如激酶活性的测定及DNA-蛋白相互作用等），制定计划；了解相近物种该基因的信息，以利于扩增过程中预测PCR的延伸时间；,同源片段的克隆,本实验室的EST数据库；NCBI数据库；RT-PCR用兼并引物扩增同源片段；设计兼并引物是重点！,注意事项：,高质量的mRNA和高效率的逆转录；加大引物浓度；选择mRNA表达量高的组织做模板；梯度PCR或者降落PCR；巢氏PCR;序列分析；,3RACE:,原理：,5RACE,原理：,注意事项：,RNA的完整性；高效的逆转录酶；多次5RACE相结合；应用丰度高的组织做模板；长片段扩增应用LA-Taq酶；同源克隆方法；用随机引物或者OligoT引导逆转录；,序列分析,引物设计：Primer 5.0；一般的序列处理：DNAStar中的Editseq；序列拼接：DNAStar中的Seqman、BL2；序列在线比对：NCBI-BLAST()；序列多重比对：Bioedit、ClustalW2()；寻找ORF:Editseq、ORF Finder()；序列作图：Bioedit、EMBOSS()；构建进化树:MEGA 4.1；,蛋白结构域分析：SMART()；蛋白理化性质分析及二、三级结构分析：EXPASY()、Psipred()；信号肽分析：SignalP()；磷酸化位点分析：NetPhos 2.0 Server()；糖基化位点：NetNGlyc 1.0 Server()；,引物设计,兼并引物RACE引物荧光定量引物染色体步移引物原核表达用引物PCR-SSCP引物,总原则,引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。产物不能形成二级结构。引物长度一般在1530碱基之间。G+C含量在40%60%之间。碱基要随机分布。引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物5端可以修饰。引物3端不可修饰。引物3端要避开密码子的第3位。,兼并引物,兼并碱基：M=A/C R=A/G W=A/T S=G/C Y=C/TK=G/T V=A/G/C H=A/G/T D=A/G/T B=G/C/T N=A/G/C/T 简并度：,兼并引物设计步骤,利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列 对所找到的序列进行多序列比对确定合适的保守区域设计兼并引物（软件或者人工）,选择合适的序列进行多重比对；选择高度保守的序列作为引物；人工设计时要注意引物序列是和原序列相同还是反向互补的；简并度不能太高，可用次黄嘌呤代替N；引物的3端残基尽可能使用确定残基；降落PCR;巢氏PCR;,RACE引物,各3条重叠的引物，引物之间最好距离100-200bp；若同源片段长度太短，可先做3RACE，再做5RACE；尽量靠近cDNA末端（3RACE-3末端；5RACE-5末端）；,荧光定量引物,纯化方式：PAGE；产物长度：80-150bp；TM值:58-62;在编码区内靠近3末端处设计；高的特异性：测序及熔解曲线分析；,染色体步移引物,以DNA为模板设计引物；3条重叠引物；高的退火温度：高于60度；,原核表达用引物,会读表达载体图谱；去除信号肽序列；根据目的表达序列直接取相应序列作为引物，注意要不要加终止密码子；在引物的5末端加酶切位点和相应的保护碱基，注意方向；选酶切位点：选择常用的内切酶，并看这两种酶是否可以在统一体系中进行双酶切；,PCR-SSCP引物,PCR产物长度：150-400bp；高的特异性；,染色体步移克隆启动子,Tail-PCR,荧光素酶活性检测 试剂盒,谢 谢！,