《基因工程导论》PPT课件.ppt

基因工程,曹永长 教授华南农业大学动物科学学院,生物技术,生物技术(Biotechnology)是一门新兴的综合的学科,有时也称生物工程(Bioengineering)，是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他学科的技术原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。,生物技术的种类,1、基因工程(gene engineering)2、细胞工程(cell engineering)3、酶工程(enzyme engineering)4、发酵工程(fermentation engineering)5、蛋白质工程(protein engineering),五大技术之间的关系,基因工程,应用人工方法把生物的遗传物质(DNA)分离出来,在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个体,从而改变它们的遗传品性;有时还使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物(多肽或蛋白质)。这种创造新生物并给予新生物以特殊功能的过程就称为基因工程,又叫DNA重组技术。基因克隆（gene cloning），DNA克隆（DNA cloning），分子克隆（molecular cloning)，基因工程（gene engineering），遗传工程（genetic engineering）等术语常与重组DNA技术通用。,基因工程理论依据,1、不同基因具有相同的物质基础。2、基因是可以切割的。3、基因是可以转移的。4、多肽与基因之间存在对应关系。5、遗传密码是通用的。6、基因是可以遗传的。,遗传物质DNA,在每轮DNA复制过程中，DNA分子的每条链均被用作合成其互补链的模板。因此，经过多代复制之后，其遗传信息仍然保持完整。DNA复制是“半保留”的，因为子代DNA双螺旋由一条亲代链与一条新合成的链组成。,DNA的复制,中心法则,DNA是遗传信息的一级载体，能够被转录成RNA，并进行蛋白质的合成，这就是遗传信息流。DNA RNA 蛋白质,瞧这一家子！,Prokaryotic cell,Eukaryotic cell,两种动物性别决定基因的部分比较人与鲸的外形十分不同，但他们仍然由大体上相同的蛋白质组成。尽管人与鲸的分化时间已经很长，但他们许多基因的核苷酸序列还非常相似。图中展示了人与鲸中编码雄性决定蛋白基因的一部分序列，阴影部分是两者完全相同的部分。,各种生物共享相同的分子机制图中显示婴儿及小鼠的前额部都有相似的白班，因为他们各自的kit基因都有缺陷。色素细胞的发育和存活都需要这个基因。,基因工程研究发展史,准备阶段：1944年，Avery等通过细菌转化研究，证明DNA是基因载体。1953年，Watson和Crick建立DNA分子的双螺旋模型。19581971，确立中心法则，破译64种密码子。19601970，发现限制性内切酶和DNA连接酶。1972年，首次构建重组DNA分子。,基因工程问世,1973年，Cohen等首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌的转化；同时，他们将非洲爪蟾含核糖体基因的DNA片段与质粒pSC101重组，转化大肠杆菌，转录出相应的mRNA。,基因工程迅速发展阶段,（1）19801990年代，基因工程基础研究趋于成熟，发展了一系列新的基因操作技术，构建了多种载体，获得了大量转基因菌株。（2）1980年培育第一个转基因动物超级鼠。（3）1983年培育出第一例转基因植物转基因烟草。（4）大量的基因工程药物研究成功。,基因工程的基本程序,分载体和目的基因的分离切限制性内切酶接载体与目的基因连接成重组体转基因序列转入细胞筛目的基因序列克隆的筛选和鉴定,分载体和目的基因的分离,目的基因的来源和分离基因文库cDNA文库人工化学合成聚合酶链(PCR)反应,切限制性内切酶的应用,限制性内切酶（restriction endonuclease）,该酶有三类，即限制性内切酶，。实际工作应用的为限制性内切酶，它能识别和切割双链DNA的特异顺序，产生特异的DNA片段。型具有严格的识别、切割顺序。它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5端为P，3端为OH。识别顺序一般为4-6个碱基对。,不同限制性核酸内切酶切割的三种情况,产生3突出粘性末端（cohesive end):以EcoR I为例：5-G AATTC-3 5-GP OHAATTC-3 3-CATAAA G-5EcoR I 3-CTTAAOH PG-5产生5突出粘性末端:以Pst I为例：5-CTGCA G-3 5-CTGCAp OHG-3 3-G ACCTC-5 Pst I 3-GOH p ACGTC-5产生平末端（blunt end):以Nru I为例：5-TCG CGA-3 5-TCGp OHCGA-3 3-AGC GCT-5 Nru I 3-AGCOH pGCT-5,接载体与目的基因连接成重组体,粘性末端连接 平端连接,DNA连接酶,T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶：MW=68kD，催化两个独立DNA片段5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键,转基因序列转入细胞,转化 感染 转染,筛目的基因序列克隆的筛选和鉴定,按重组载体的标志进行筛选 核酸杂交法 核苷酸序列测定 PCR 免疫学方法 DNA限制性内切酶图谱分析,基因克隆的载体,载体（vector）是携带靶DNA片断进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。载体的本质是DNA，具备以下特征：自主复制；有筛选标记；适当大小的分子量适当的限制性内切酶酶切位点；在细胞中拷贝数高。质粒载体（plasmid）载体 噬菌体载体（bacteriophage）,质粒载体,质粒是细菌染色体外小型双链环状DNA。质粒DNA在细菌中的复制有两种类型，即严紧型和松驰型，后者为高拷贝质粒，常用于基因克隆实验。常用的质粒载体有pBR322，pUC18和pUC19。,噬菌体载体,-噬菌体载体：gt10、gt11、EMBL4、粘粒载体M-13噬菌体载体T4噬菌体载体,噬菌体载体,插入载体(Subsitution vector):gt10和gt11，只有单一的EcoR酶切位点，只容许几个kB的外源DNA插入。此类载体主要同于cDNA文库的构建。替代载体（replace vector)：EMBL4，含有EcoR(E)、Sal(S)和BamH(B)三个限制性内切酶位点。酶切后可用外源性DNA取代。指入片段长度为9-22kb。主要用于构建基因组文库。,M13噬菌体载体,M13噬菌体含约64kb的单链闭环DNA分子。在菌细胞内形成过度阶段的双链环状复制型DNA（RF）。双链外源DNA可插入到M13噬菌体，双链复制型DNA中并进行高拷贝复制。亦很容易地从感染细胞中纯化得到并重新导入宿主细胞，进入宿主细胞后，这种双链DNA很快又重新进入复制周期，产生子代噬菌体颗粒。子代噬菌体DNA是单链的，只含有外源DNA的一条链。主要用于DNA测序和制备单链放射性探针,利用T4噬菌体头部表面的非必需外壳蛋白，将目的蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面。具有操作方便、容量大、拷贝数高，表达产物保持相对独立的空间构象和生物学活性、易于分离、免疫原性强等优点。,T4噬菌体表面蛋白展示系统,T4噬菌体表面蛋白展示系统,质粒表达系统：表达质粒 大肠杆菌噬菌体展示系统：缺失突变型T4-Z1 整合质粒 大肠杆菌,T4噬菌体表面蛋白展示系统,基因工程研究内容,基础研究应用研究,基础研究,（1）基因工程克隆载体研究（2）基因工程受体系统研究（3）目的基因研究（4）基因工程工具酶研究（5）基因工程新技术研究,应用研究,（1）新药开发（2）转基因植物（3）转基因动物（4）其他方面酶制剂工业、食品工业、化学与能源工业、环境保护等,新药开发,1、抗生素：6000多种抗生素，其中约100种被广泛使用，每年市场销售额约100亿美元。利用重组DNA技术，提高抗生素产量和生产效率。2、激素：生长激素、生长激素释放抑制激素、胰岛素、心钠素等。3、其他药物：干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子等。,用基因工程方法生产的部分人类蛋白质药物（1）,蛋白质名称 用途a1抗胰蛋白酶 治疗肺气肿促肾上腺皮质激素 治疗风湿B细胞生长因子 治疗免疫系统功能失调降钙素 治疗软骨病集落刺激因子 治疗血液病、肿瘤辅助治疗绒毛膜促性腺激素 治疗不排卵症内啡肽和脑啡肽 镇痛剂上皮生长因子 促进伤口愈合红细胞生成素 治疗贫血,用基因工程方法生产的部分人类蛋白质药物（2）,蛋白质名称 用途凝血因子VIII 治疗血友病凝血因子IX 治疗血友病生长激素 促进生长生长激素释放因子 促进生长胰岛素 治疗糖尿病干扰素 抗病毒、抗肿瘤白细胞介素 治疗癌症淋巴细胞毒素 抗肿瘤巨嗜细胞激活因子 抗肿瘤,用基因工程方法生产的部分人类蛋白质药物（3）,蛋白质名称 用途神经生长因子 促进神经系统损伤的修复血小板衍生因子 治疗动脉粥样硬化松弛素 助产剂血清白蛋白 血浆补充物生长调节素 生长调节素组织型纤溶酶原激活剂 溶栓剂肿瘤坏死因子 抗肿瘤尿抑胃素 抗溃疡药物尿激酶 溶栓剂,我国已批准上市的基因工程药物,名称 适应症重组人干扰素a1b(外用)病毒性角膜炎重组人干扰素a1b 乙肝、丙肝等重组人干扰素a2a 尖锐湿疣、疱疹、乙 肝、丙肝等重组人干扰素a2b 乙肝、丙肝重组人干扰素-r 类风湿、癌症辅助治疗重组人白细胞介素-2 癌症辅助治疗重组人粒细胞集落刺激因子 化疗生白细胞重组人红细胞生成素 再生障碍性贫血碱性成纤维细胞生成因子 创伤、烧伤,基因工程与疫苗,甲型、乙型病毒性肝炎疫苗肠道传染病疫苗（霍乱、痢疾等）寄生虫疫苗（血吸虫、疟疾等）流行性出血热疫苗、EB病毒疫苗等爱滋病毒疫苗避妊疫苗：精子避妊疫苗、激素类避妊疫苗,转基因的定义,转基因动物Transgenic animal 在受精卵时进行基因转移，使最后获得含有外源基因的动物，获得新基因的特性杂合动物Chimeric animal 采用胚胎干进行基因转移，使动物的某些细胞获得外源基因，这些细胞局限于某些组织中，而其它组织细胞中则并无外源基因，因此呈杂合状态基因敲除Knockout mutation 采用同源重组的方法使某个基因发生缺失或灭活，从而失去功能，通常当对受精卵进行基因敲除则产生的动物便因某种基因缺失，而对其生长、发育及其它代谢过程产生影响,转基因的物种模型,Arabadopsis(plant)C.elegans(worm)Fruit flies Xenopus(frog)ZebrafishMice,RatsPigs SheepGoatsCows,被转移基因的类型,小分子重组DNA(Small recombinant DNA molecules)采用基因或其cDNAs 构建适当的表达载体，以基因转移技术导入宿主细胞中以获得外源基因的表达报告基因(Reporter constructs)目标基因的启动子与某些较易检测的基因相连构建成表达盒子，采用检测报告基因的表达来分析目标基因的启动子的强弱及其调控，这些报告基因有GFP,lacZ,luciferase）大分子天然DNA(Large native DNA molecules)酵母人工染色体(yeast artificial chromosomes,YACs)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes,BACs),青蛙是最早进行转基因试验的动物之一当时并非采用分离DNA的技术，而是采用核转移技术，即现在采用的动物克隆技术当时建立了核的显微注射技术,转基因小鼠,转基因小鼠是最早问世的转基因动物。1982年将生长激素基因转入小鼠获得成功，转基因小鼠的体重是正常个体的二倍，被称为“超级鼠”。转基因小鼠证明了生物技术可以改变动物的天然属性，显示了转基因动物的广阔应用前景。,转基因小鼠的产生,Example of transgenic mouse,基因靶向技术:基因敲除小鼠或突变小鼠,Generation of mutant(chimeric)mouse strain,electroporate targeting vector,microinjection into black embryo,X,homologous recombination,screen chimera progeny,+/+,+/+,+/-,基因敲除小鼠,对于发现有价值基因十分有益，尤其是某些自然状态下不存在的突变株特别提示研究发现，基因敲除小鼠通常并不受基因缺失的影响，许多基因表现为非依赖性，即非必需基因大多数基因表现为多能性，具有多种生物学功能，它们在不同的组织中，以不同的方式进行表达，尤其在发育的不同的阶段的表达对于其生物学功能，从更全面的层次进行理解,应用转基因技术的研究,解救突变体以转基因鼠作为生物反应器合成人单克隆抗体合成其它有价值蛋白结构与功能关系研究人类疾病的小鼠模型分析疾病的细胞与分子机制指导治疗药物的筛选指导基因治疗,按受累的器官和组织系统列表的鼠疾病模型,中枢神经系统疾病 11视觉与听觉障碍疾病 7骨、皮肤和结缔组织相关疾病 16神经和神经肌肉障碍性疾病 22肿瘤 11免疫学和血液系统疾病 17激素和代谢障碍性疾病 24多因性人类疾病 6,遗传性疾病的小鼠模型举例,镰刀状细胞贫血(Sickle cell disease)采用基因敲除和转基因建立小鼠的镰刀状细胞贫血，特性地将内源性球蛋白基因缺失，造成小鼠的镰刀状细胞贫血肺中囊性纤维化(Cystic fibrosis)主要采用基因敲除模型，也有少数采用转基因多囊肾疾病治疗(Polycystic kidney disease)y 主要采用基因敲除技术嗜眠症(Narcolepsy)基因敲除模型及思考,转基因鱼,1984年，朱作言等首次采用人生长激素基因(hGH)构建了转基因金鱼。目前已有鲫鱼、鲤鱼、泥鳅、鳟鱼、大马哈鱼、鲶鱼、罗非鱼、鲂鱼等被用于转基因研究。已有多种哺乳动物和鸟类的基因被成功地整合到鱼类基因组中。,转基因鱼,转基因鱼的主要目的是：（1）提高鱼类生长速度和抗逆性。生长激素基因(哺乳动物、鸟类、鱼类)；抗冻蛋白基因（拟鲽）（2）作为发育生物学研究的模型。,转基因鸡,家禽受精卵从输卵管排出需要20多个小时，产出时的卵已有6000多个细胞。蛋产出前的操作：受精后第一次卵裂前取出单细胞卵，在体外进行转基因操作，然后用代用蛋壳作为培养器皿在体外培养至孵化。英国Perry et al采用显微注射法获得了转基因鸡。精子载体法是很有前途的转基因家禽方法。,转基因鸡,蛋产出后的操作：胚胎干细胞(ES)法和原生殖细胞(primordial germ cell,PGC)法。转基因家禽主要以抗病性和改良生产性状为目标。（抗流感病毒基因Mx 1、生长激素基因）用鸡蛋生产外源蛋白。,转基因家畜,哺乳动物体外受精饿胚胎移植技术为转基因家畜的成功提供了有效的技术手段。提高抗病性和改善生产性能。因为家畜与人的生物学相似性，在器官移植、药物生产和特殊疾病模型等方面显示出特殊的价值。,In 1997,researchers at Scotlands Roslin Institute sparked international debate when they announced the cloning of a sheep named Dolly.The event brought humankind to another crossroads of scientific research and ethical concerns.This special report uses background stories and opinion pieces to review the latest developments in cloning research and to present the breadth of legal and ethical,转基因动物的应用前景,1、转基因动物是深入了解多种生命现象本质的工具。2、可以用来建立多种疾病的动物模型，进而研究这些疾病的发病机理及治疗方法。3、提高动物育种效率。4、转基因动物作为医用或食用蛋白的生物反应器。,转基因动物生物反应器,1、同源组织表达蛋白质。2、乳腺生物反应器。3、膀胱生物反应器。,转基因植物,提高农作物产量及其品质,1、培育抗逆的作物优良品种。抗病毒、抗虫、抗细菌和真菌2、提高粮食品质。3、抗旱、抗热、抗寒、抗盐品种的培育。,抗除草剂作物,1、草甘膦内丙酮莽草酸磷酸合成酶(EPSP)分离抗草甘膦的EPSP合成酶突变基因基 因转移作物获得抗草甘膦能力。2、膦丝菌素(PPT)抑制谷氨酰合成酶（GS）从链霉菌中分离到抗bialaphos(含有PPT的三肽)的bar基因将bar基因转移到植物中，其产 物PAT通过对PPT和bialaphos的乙酰化使其失 去抑制GS的能力。,用转基因植物生产可食用疫苗,可食用疫苗：采用转基因植物技术，用植物生产疫苗抗原，通过食用含有抗原的植物的可食用组织，达到免疫的目的。,香蕉被认为是研究人类可食用疫苗的最佳选择,土豆也常被用来研究可食用疫苗,DNA重组技术的可能性与限制,从基因克隆到人的克隆技术的复杂程度和涉及多学科协同安全问题及伦理学,