《基因工程制下》PPT课件.ppt

第五节 基因工程菌的稳定性,基因工程菌在传代过程中会出现质粒不稳定现象，包括分裂不稳定和结构不稳定。,质粒不稳定产生的原因：1.含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率2.含质粒和不含质粒菌的比生长速率差异的大小3.细胞中所含质粒载体的拷贝数：拷贝数差别不大时，质粒载体相对地稳定；拷贝数相差悬殊，则很容易造成一些细胞丢失质粒，并逐渐发展为优势群体。4.宿主细胞DNA重组系统的作用：质粒载体之间发生重组会形成二聚体、三聚体，甚至四聚体等所谓的质粒寡聚体，其稳定性比单体差。质粒载体中外源DNA片段的大小同质粒寡聚化的程度也密切相关5.质粒的拷贝数除与工程菌本身的特性有关外，还与培养条件有关。,1.含低拷贝质粒数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率大，增加拷贝数能提高质粒的稳定性2.含高拷贝质粒数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但大量外源质粒的存在使含质粒菌的比生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快取代含质粒菌而成为优势菌，所以对这类菌不能简单地采取提高质粒拷贝数的方法。,高拷贝质粒菌中质粒拷贝数增加与产物增加往往不成正比，这可能是含高拷贝质粒菌中，蛋白合成的限速步骤是转录和翻译，基因的大量复制加重了转录和翻译的负担，使得蛋白质合成速度变慢。,质粒稳定性的分析方法：,工程菌,涂布不含抗性平板,随机挑取100个菌落,稀释,1012h,接种,含抗性的平板,1012h,菌落计数,提高质粒稳定性的方法：,1.两阶段培养法可有助于提高基因工程菌的稳定性,2.在培养基中加入选择压力，如抗生素，也可抑制质粒的丢失,3.采用适当的操作方法可使工程菌生长速率具有优势，并使工程菌和质粒丢失菌生长竞争趋于极端化,第六节 基因工程菌生长代谢的特点,一、菌体生长与能量的关系：,菌体生长由呼吸控制，各种碳源通过有限的呼吸能力所能提供的最大能量决定了菌体在培养基中的最大比生长速率,当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体常会产生乙酸，乙酸会对菌体的生长起抑制作用。乙酸的产生是因为供能不足，菌体将乙酰辅酶A转变为乙酰来供能。,采取各种方法，控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，避免乙酰辅酶A和乙酸的产生。,通过代谢工程，提高菌体摄氧能力，可减少乙酸的生成。如在大肠杆菌中表达有摄氧能力的细菌血红蛋白（VHB），可提高菌体的氧摄取能力。,减少乙酸的方法：,二、菌体生长与前体供应的关系,在基础培养基中加入氨基酸能使菌体比生长速率提高，蛋白合成增加。,在同样培养基中，工程菌的生长速度低于其宿主菌的生长速度，特别是工程菌诱导后外源基因的表达一起菌体生长速率下降，甚至停止生长。,（1）前体供应不足时，会产生“严紧反应”，氨酰tRNA不足，核糖体在密码子上停留，产生调控物ppGpp，使RNA聚合酶在模板上移动产生停顿，mRNA和rRNA减少，核糖体合成减少。（2）核糖体数量减少，则减少了氨酰tRNA的不足，减少了核糖体在肽链延长时的停顿和ppGpp的合成，在较低的比生长速率下达到平衡。,第七节 基因工程菌发酵,一、基因工程菌的培养方式,1.补料分批培养:为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长生长对数期，获得高密度菌体，间歇连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。,2.连续培养：由于基因工程菌的不稳定性，连续培养很难做到。,3.透析培养：将培养基用半透膜进行透析，去除其中对菌生长有抑制的物质。,4.固定化培养：可提高质粒的稳定性,二、基因工程菌的发酵工艺,（1）培养基的组成C源：如使用葡萄糖，则要防止对Lac操纵子的影响。N源：常使用酪蛋白水解物，另外胰蛋白胨、牛肉膏、玉米浆也为常用N源。,（2）以pET载体、大肠杆菌BL21(DE3)为例，常用的发酵培养基有：LB培养基：蛋白胨：10g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：10g/L。玉米浆培养基：玉米浆 2.5%，牛肉膏 1.5%，谷氨酸钠 1%。玉米浆 2.5%，牛肉膏 1.5%，谷氨酸钠 1%。,1.培养基的影响,2.接种量的影响：影响发酵的产量和发酵周期，接种量小，延长菌体延迟期，不利于外源基因表达，采用大接种量，有利于缩短延迟期，并能减少污染。,3.温度的影响：（1）温度扩增敏感型质粒，对此类工程菌，先在较低温度下培养，然后升温，以大量增加质粒拷贝数，诱导外源基因表达。（2）温度影响蛋白质的活性和包含体的形成。如表达GM-CSF的工程菌，在30度表达量最大，而在37度，由于细菌热休克系统被激活，大量的蛋白酶被诱导，导致表达产物被降解。表达人GH的工程菌，30度为可溶，37度成包含体。,4.溶氧量的影响：工程菌中外源基因的表达需要大量的能量，促进了细胞的呼吸作用，提高对氧气的需求，因此维持较高的水平的溶氧量（40%）才能提高带有重组质粒细胞的生长，利于外源蛋白的表达。,5.诱导时机的影响：一般在对数生长期或对数生长后期诱导表达，此时菌群数目倍增，对营养和氧需求激增，营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素。,6.pH的影响,可溶性蛋白，诱导后2，3，4，5，6小时后，目的蛋白的表达量,包含体，诱导后2，3，4，5，6小时目的融合蛋白表达量,第八节基因工程药物的分离纯化,（三）初步分离 1.分离细胞器：离心，超离心 2.除核酸：酶法DNase,RNase；超声 3.除脂肪：丙酮，脂肪酶（四）粗分蛋白 1.盐析：NaCl，(NH4)2SO4沉淀 2.有机溶剂抽提：甲醇，乙醇，丙酮 3.等电点沉淀：除去杂蛋白 4.热变性：除去杂蛋白（五）除盐 1.超滤 2.凝胶过滤 3.冻干,4 层析一般步骤：,处理介质装柱平衡上样洗涤洗脱介质再生,3 注意问题：(1)缓冲液的选择：阳离子：Tris 阴离子：磷酸盐，柠檬酸盐(2)介质处理：阳离子：Na+型 阴离子：Cl-型(3)洗脱：原理：i改变盐浓度 ii改变pH值方式：i连续洗脱 ii梯度洗脱(4)介质再生,非蛋白质类杂质的去除：（1）DNA的去除：采用阴离子交换或疏水层析去除（2）去热源：生产过程中要作到无菌，在低温下操作，最后产品要通过过滤灭菌。采用阴离子交换、疏水层析、或亲和层析可去除热源物质。（3）病毒的去除：色谱分离或过滤能去除病毒。,第九节 基因工程药物的质量控制,一、原材料的质量控制：确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。见PAGE 100101。,二、培养过程的质量控制：见page 101。,三、纯化工艺过程的质量控制：见page101。,四、目标产品的质量控制：鉴别、纯度、活性、安全性、一致性。,1.产品的鉴别：,（1）肽图分析：用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进行分离分析。该法是检测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法，蛋白质降解形成的肽段可通过测定氨基酸组成、N端序列或采用HPLC-MS或毛细管电泳等方法进行鉴定并与标准品比较。,（2）氨基酸成分分析：蛋白质在酸性或碱性条件下水解后，用氨基酸分析仪进行组成分析。注意：碱水解会引起精氨酸、胱氨酸及部分赖氨酸被破坏；酸水解条件下，色氨酸、酪氨酸易被破坏。,（3）部分氨基酸序列分析：测定N端15个氨基酸，作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。,（4）重组蛋白质的浓度测定：双缩脲法、常用染料（如R-250或G-250）结合比色法、福林-酚法、紫外分光光度法。,（5）重组蛋白相对分子量的测定：分子筛法、SDS-PAGE法、质谱法。使用这些方法可判断重组蛋白是否为单体或多聚体。,双向对角线SDS-PAGE：既无链内又无链间二硫键的分子位于对角线上(两向电泳中分子迁移率相等);存在链内二硫键的分子位于对角线的上方(第一向泳动快,第二向泳动慢);而存在链间二硫键的分子由于第二向电泳时被还原,分子变成小的肽链而位于对角线的下方。,（6）二硫键分析,单向SDS-PAGE：存在链内二硫键的分子在非还原的SDS-PAGE 中没有完全伸展,结构更紧密而较在还原的SDS-PAGE 中泳动快;存在链间二硫键的分子在还原的SDS-PAGE 中被还原,分子变为小的肽链而较在非还原的SDS-PAGE 中泳动快。,（7）重组蛋白结构分析,二级结构分析：常用圆二色性，测定二级结构中-螺旋、转角、-折叠及无规卷曲的含量，并与天然蛋白的二级结构进行比较。,高级结构分析：X-射线衍射及核磁共振。,2002年度的诺贝尔化学奖获得者之一维特里希（Kurt Wthrich）（瑞士苏黎士联邦理工学院）教授的贡献是把核磁共振（NMR）分析方法应用到了生物大分子(蛋白质和核酸)的结构研究中，建立了一套完整的确定生物大分子空间结构的方法。,2.纯度分析,（1）目的蛋白质含量测定：常用方法有还原或非还原SDS-PAGE法、HPLC、毛细管电泳等。,（2）杂质：包括蛋白和非蛋白杂质,蛋白类杂质：包括宿主细胞蛋白和目的蛋白自身由于降解、聚合、错误折叠而造成的蛋白变构体。这些变构体容易抗体的产生，需要严格控制。,非蛋白类杂质：包括病毒、细菌、热原、内毒素、致敏原、DNA等。,3.生物活性测定：需要通过动物体内试验和细胞培养进行体外测定。此外，需要测定重组蛋白的抗原性，防止其过强的免疫原性诱发体内产生免疫反应造成伤害。还有长期毒性实验。体内测定：建立合适的动物模型体外测定：细胞培养计数法、3H-T R掺入法等。,4.稳定性考察：防止其在储藏过程中的脱氨、氧化、磺酰化、聚合或降解等造成的分子变化。,5.产品一致性的保证,1.液态保存低温保存在稳定pH下保存高浓度保存：浓度高，蛋白质比较稳定。加保护剂保存：多数蛋白质在疏水环境下稳定，可加入稳定剂如糖类、脂肪类、蛋白质类、多元醇、有机溶剂；有些蛋白质在高离子强度下稳定，可加入中性盐；有些蛋白质易氧化，可加入一些还原剂。,五、产品的保存,2.固态保存：制成干粉或结晶，在干燥器中4度可长期保存。,第十节 基因工程药物的制造流程,质量控制标准和要求：,（1）干扰素效价测定（2）蛋白质含量测定：福林-酚法（3）比活性：干扰素效价的国际单位与蛋白质质量的毫克数之比。（4）纯度测定：非还原型SDS-PAGE,银染为单一条带，扫描仪测定纯度95%；HPLC测定呈一个吸收峰，或主峰占峰总面积的95%以上。（5）相对分子量测定：还原型SDS-PAGE法，与标准蛋白质MARKER比较，与理论值误差不得大于10%。（6）残余外源性DNA测定：探针杂交，应低于100pg（7）残余血清IgG含量测定（8）残余抗生素活性测定（9）紫外光谱扫描：最大吸收峰应为280+2nm（10）肽图测定：用CNBr裂解法（12）等电点测定：用等电聚焦法,成品检定,（1）物理形状：冻干制品为白色或为黄色疏松体，加水后不含有肉眼可见的不溶物。（2）鉴别试验：ELISA法（3）水分测定（4）无菌试验（5）热原试验（6）干扰素效价测定（7）安全试验：豚鼠腹侧皮下注射剂量为人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，局部无红肿、坏死、总体重不下降即为合格；5只小鼠尾静脉注射剂量为人3倍药物，观察7天，若动物全部存活为合格。,