《基因工程上》PPT课件.ppt

基 因 工 程,基因重组(DNA重组):将不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接而形成新的DNA分子的过程,基本概念,克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体,分子克隆是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新的遗传特征的过程。,基因工程的概念：利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程.,基因工程(gene engineering)常和以下名称混用,遗传工程(genetic engineering);基因克隆(gene cloning);分子克隆(molecular cloning);基因操作(gene manipulation);重组DNA技术(recombination DNA technique),1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)，并与之一起增殖。4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。,基因工程的主要内容或（步骤）,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,1996年7英国爱丁堡罗斯林（Roslin）研究所用药物促使母羊排卵，将卵吸空，制成空卵壳，再从母羊乳腺中取出一个体细胞，使它与卵壳合成一个含有遗传物质的卵细胞。当卵细胞分裂形成胚胎后被植入母羊子宫内，母羊产下了与自己有相同基因的多莉！,第一节重要的工具酶,一、限制性核酸内切酶二、DNA聚合酶三、逆转录酶四、DNA连接酶五、碱性磷酸酶六、末端脱氧核苷酸转移酶,一、限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶(RE)是由细菌产生的一种能识别双链DNA中的特定位点，并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶(简称限制酶或内切酶)，多在原核生物中存在.,限制酶的分类I型限制酶：具有限制和DNA修饰作用，这种酶通常在识别位点下游1001000bp处切割DNA；型限制酶：与I型酶一样，具有限制与修饰活性，能在识别位点附近切割DNA，切割位点很难预测.型限制酶：能在DNA分子内部的特异位点识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定,是基因工程常用酶。,限制酶的命名,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。另外用罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号，现在常用来表示发现的先后次序,EcoR：E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株 I代表该菌株中首次分离到的核酸内切酶,粘性末端,在识别序列的两个对称点切开DNA双链，产生带单链尾的粘性末端,限制酶的识别和切割位点特点：4-8个bp，具有回文结构的DNA片段,平末端：切割点是识别序列的对称轴，产生平端或钝端(blunt end)。如Sma,BamH,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,特殊性质的型限制酶：,同裂酶：又称异源同工酶，是从不同的原核生物中分离出来的不同的酶。它们识别相同的序列，在切割DNA时，其切割点可以是相同的，也可以是不同的。例如：Aha 和Dra的识别和切割序列都相同，产生平端：,又如Kpn和Asp718的识别位点相同，但切割位点不相同，前者产生3粘性末端，而后者产生5粘性末端,同尾酶(isocaudarner)：有些限制酶的识别序列不同，但是它们作用后产生相同的粘性末端，故称为同尾酶。例如Mbo、BamH、Bgl的识别切割序列分别为：,二、DNA聚合酶,(一)DNA聚合酶I 催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针；第二条cDNA链的合成；对DNA3突出末端标记；DNA序列分析。,(二)Klenow片段,用枯草杆菌蛋白酶可将DNA聚合酶I裂解为36kD和76kD两个片段，大片段称为Klenow片段.具有53聚合酶活性及35外切酶活性，而失去了53外切酶活性。它具有的35外切酶活性能保证DNA复制的准确性，把DNA合成过程中错误配对的核苷酸去除，再把正确的核苷酸接上去。,补齐双链DNA的3末端。5-G-OH Klenow 5-GTTAA-OH 3-CAATT-OH dATP,dTTP 3-CAATT-OH,Klenow片段的主要用途：,在cDNA克隆中，第二股链的合成。,DNA序列分析。,3末端标记。5-G-OH Klenow 5-GTT*A*A-OH 3-CAATT-OH d*ATP,dTTP 3-CAA T T-OH,(三)TaqDNA聚合酶,TaqDNA聚合酶是一种依赖DNA的耐热DNA聚合酶 主要用于聚合酶链反应(PCR)中，能以DNA为模板，以结合在模板上的引物为起点，以dNTP为原料，按碱基配对方式，从53方向合成新的DNA链。TaqDNA聚合酶在7075oC时具有最佳的生物活性，随着温度的降低，酶活性明显下降。同时此酶缺乏35外切酶活性，无校正功能。,三、逆转录酶,以RNA为模板合成DNA的DNA聚合酶称为逆转录酶，合成的DNA产物称为互补DNA(cDNA)。应用于：将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；补平和标记5-末端突出的DNA片段；代替Klenow酶用于DNA序列分析；制备杂交探针等。,四、DNA连接酶,DNA连接酶催化双链DNA一端3端羟基与另一双链DNA的5端磷酸基连接，形成3,5-磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA末端连接起来。从而把两个DNA分子连接起来，或连接双链DNA中一条链的切口最常用的DNA连接酶是由T4噬菌体编码的T4 DNA连接酶。要求：两个双链DNA片段间存在互补的粘性末端或平头末端,五、碱性磷酸酶,碱性磷酸酶能去除DNA或RNA 5端的磷酸根用途：制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率,将脱氧核苷酸加到DNA的3端羟基上，主 要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。,六、末端脱氧核苷酸转移酶,第二节基因克隆常用的载体,概念：载体(vector)是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接，实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的DNA分子。,外源 DNA一般没有明显的遗传标志，如果将其直接导入宿主细胞，没有有效的方法能将导入了外源 DNA片段的细胞和未导入外源DNA的细胞区分开来。外源 DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细胞的繁殖而复制，即没有自主复制能力，达不到使外源DNA片段扩增的目的。,如果要将外源 DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达，就需要有一个能在该宿主细胞内进行自我复制和表达的载体来携带。外源DNA片段与载体在体外连接，构成重组分子，然后导入宿主细胞，使之进行扩增或表达。,一、载体的分类,(一)克隆载体(cloning vector)-为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。包括:质粒、噬菌体以及病毒等,载体必须具备以下基本条件：有自身的复制子，能借助自身的复制和调控系统对携带的目的基因进行复制增殖；具备多克隆位点，易于外源DNA分子与载体连接及重组；具有多个利于选择和筛选的遗传表型或标志，包括抗药性、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应等；有足够的容量以容纳外源DNA片段，同时具有拷贝数高、易与宿主细胞的DNA分离并易提取、抗剪切力强等特点；可导入受体细胞。,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,基因载体,(二)表达型载体(expression vector)：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。表达型载体除具有克隆载体所具有的特性外还具备表达系统元件原核表达载体的表达系统元件是启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号真核表达载体的表达系统元件是启动子-核糖体结合位点-克隆位点-终止信号和poly(A)信号,粘粒(cosmid)(超纯质粒),噬菌体(phage),质粒（plasmid）,近年来发展了一系列新的载体系 统，它们能在细菌中扩增，在真 核细胞中表达。,病毒载体(virus),M13噬菌体(M13 phage),载体(vector)主要类型：,二、常用的载体,(一)质粒,质粒(plasmid)是细菌染色体外的遗传单位，是一种环状的双链DNA分子，其结构比病毒更简单，无蛋白外壳，也无细胞外的生命周期，是仅能存在于宿主细胞质内、独立于染色体的、自主复制的遗传成分,常用质粒载体举例,1、pBR322载体2、pUC载体,1、pBR322载体,优点：1、分子量较小，为4363bp，不仅利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大。2、具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。3、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。,2、pUC18和pUC19,pUC系列质粒载体具有三个显著特点：（1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含500-700个拷贝）。（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ，可利用-互补原理进行蓝白筛选。（3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。每一种限制性内切酶会产生不同的粘性末端，可选用两种内切酶组合在质粒载体和外源DNA上产生相同的末端，进行双粘端连接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。,pUC18和pUC19载体,2噬菌体：可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的噬菌体载体。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。,第三节重组DNA基本原理,1.目的基因的获取2.克隆载体的选择与构建3.外源基因与载体的连接4.重组DNA导入受体菌5.重组体的筛选6.克隆基因的表达,一、目的基因的获取(一)制备基因组DNA文库 采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因组文库(genomic library)。用适当的筛选方法从菌落中选出含有某一基因的菌落，再行扩增，将重组DNA分离、回收，获得目的基因的克隆。,基因组DNA文库,限制性内切酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,(二)制备cDNA文库 以mRNA为模板，利用逆转录酶合成其互补DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增为cDNA文库(cDNA library)。采用适当方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA。在细胞中，表达基因一般仅占基因总数的15%左右，所以从mRNA出发分离目的基因极大地缩小了搜索目的基因的范围。,cDNA文库的组建：,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,(三)聚合酶链反应(PCR)如果知道目的基因的全序列或其两侧序列，可以通过合成一对与模板DNA互补的引物采用PCR 方法即可有效地分离目的基因。PCR 方法十分简捷。现代分子生物学发展到今天，人类基因组全序列已经测出，并且越来越多的生物的基因组全序列正在被测出，PCR 方法已经成为分离目的基因的主要手段。,(四)人工合成基因 人工合成基因需先知道目的基因的结构与核苷酸序列及其他相关的基因信息。应用DNA测序技术能测定基因的核苷酸序列，同时也可以通过氨基酸序列分析反推核苷酸序列。通过化学合成的方法合成目的基因。适用于小DNA分子质量的基因。,二、目的基因与载体的连接,(一)粘性末端连接(二)平头末端连接(三)人工接头法(四)同源多聚尾连接法,粘端连接,CCGG CCGG,GGCC GGCC,CGG C,C GGC,CGG C,C GGC,CCGG,GGCC,Hap,T4-DNA连接酶,平端连接,AGCT,TCGA,Alu,DNA连接酶,AGCT AGCT,TCGA TCGA,(三)人工接头法 人工接头主要用于在DNA分子的平头末端上添加新的内切酶位点，产生粘性末端，以提高连接效率。目前此方法常用于基因克隆、文库构建等操作中。,人工接头连接,BamHI,BamHI,BamHI,同聚物加尾连接,5,5,5,5,AAA,AAA,TTT,TTT,TdT酶,连接酶,(末端脱氧核苷酸转移酶),三、重组DNA导入宿主细胞,外源DNA(含目的DNA)与载体在体外连接成重组DNA分子后，需将其导入受体细胞(形成转化子)。随受体细胞生长、增殖，重组DNA分子也复制、扩增，这一过程即为无性繁殖。,进行无性繁殖时所采用的受体细胞又称宿主细胞，在选择适当的受体细胞后，经特殊方法处理，使之成为感受态细胞(competent cell)，具备接受外源DNA能力。,用作受体细胞的原核生物主要是E.coli、链球菌及枯草杆菌等，可用于重组体复制与表达。真核生物包括酵母、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等，主要用于外源真核基因的表达。,转化在基因克隆技术中，将质粒DNA及其重组体导入细菌的过程称为转化(transformation)；转染病毒及其重组体导入受体细胞称为转染(transfection)；转导噬菌体及其重组体导入受体细胞称为转导(transduction)。,根据重组载体和宿主细胞的不同，运用不同的名词描述进入过程：,四、目的基因的筛选和鉴定 将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等,最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素基因（Ampr）、抗四环素基因(tetr)、抗卡那霉素基因(kanr)等。当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。例如质粒pBR322含有Ampr、和tetr两个抗药基因，若将目的序列插入tetr基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒DNA的细胞都不能生长；凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。,1、遗传检测法,1）抗药性标志的选择,pBR322,Ampr,Tetr,插入片段,Amp平板,Tet平板,蓝-白筛选(-半乳糖苷酶法、-互补检测法),-半乳糖苷酶是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的酶，基因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为链编码的基因称之为lacZ。这两个基因（LacZ和LacZ）均可作为标记基因。lacZ（lacZ）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达半乳糖苷酶的-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码-肽）表达的lacZ基因产物（链）互补，产生有活性的半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG(异丙基-硫代半乳糖苷)的存在下(诱导物IPTG可诱导片段的合成，有活性的半乳糖苷酶能水解底物X-gal，产生蓝色化合物。)菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了lacZ-肽基因的结构，细菌内不能产生半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。,LacZ基因的结构与产物,利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNA进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法是将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维膜上，用碱裂菌，菌落释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脱。核酸探针可以用放射性核素标记，结合了放射性核酸探针的菌落集团可用放射性自显影（auroradiography）法指示出来，核酸探针也可以用非放射性物质标记，通常是经颜色呈现指示位置，这样就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。,2、原位杂交技术,3、PCR法,PCR技术的出现给克隆的筛选增加了一个新手段。如果已知目的序列的长度和两端的序列，则可以设计合成一对引物，以转化细胞所得的DNA为模板进行扩增，若能得到预期长度的PCR产物，则该转化细胞就可能含有目的的序列。,4、限制酶切图谱鉴定,DNA分子上每种限制性内切酶的识别序列分布图，称限制性图谱（restrictionmap）或称物理图谱(physicalmap)。这是在上述筛选后的进一步分析。目的序列插入载体会使载体DNA限制性酶图谱（restriction map）发生变化，例如一个长600bp的目的序列利用它两端的EcoR I和SalI切后的粘末端连接插入pUC19的多克隆点，则重组质粒就增大为3.3kb，用EooR I和SalI双酶切后会出现600bp和-2.7kb两个DNA片段，提取转化细菌的质粒DNA作酶切后做电泳观察其酶切图谱，就能分析得结果；如插入的目的序列中有其它限制性内切酶位点，也能在酶切电泳图谱上观察到。这就可以进一步鉴定重组体是不是所要的目的克隆。,5、核苷酸序列测定,所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列测定来最后鉴定。已知序列的核酸克隆要经序列测定确证所获得的克隆准确无误；未知序列的核酸克隆要测定序列才能确知其结构、推测其功能，用进一步的研究。因此核酸序列测定是分子克隆中必不可少的鉴定步骤。,外源基因在宿主细胞中的表达,重组子,目的基因的mRNA,表达蛋白质,大肠杆菌（E.coli）受体细胞,人类对大肠杆菌经过长期的研究，对其特性和遗传背景了解得最清楚，大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，人们用大肠杆菌用外源基因的表达工具已有二十多年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。,要表达真核生物的蛋白质，采用真核表达系统自然应比原核系统优越，常用的酵母、昆虫、动物和哺乳类细胞等表达系统。真核表达载体至少要含两类序列：原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。,基因载体,目的基因,质粒 噬菌体 病毒,PCR cDNA 人工合成 基因文库,限制性内切酶,有切口的载体,有切口的目的基因,DNA连接酶,重组体,转化 转染 体外包装,带重组体的宿主细胞,表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法,目的基因的表达,第四节 基因工程的应用,一、疾病基因的发现及治疗二、生产蛋白质和多肽类活性物质三、制备基因工程疫苗四、改造物种特性五、动物克隆六、其它应用,把大鼠生长因子基因转入小鼠,得到巨大型的转基因小鼠。,特殊蛋白质的大量生产,乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊,美国转基因猪，其体内含有人类的基因，乳汁含有人体蛋白fator。只需300600只这样的母猪就能满足全世界对这种蛋白的需求。,研究中心的杰拉德斯卡腾博士说，这些克隆猴将用于人类糖尿病和帕金森氏病的研究。,转基因抗虫棉,不易腐烂的番茄,植物的遗传改良,兔毛棉花在我国培育成功：用兔的一种角蛋白转化棉花，棉花纤维质量好，具有兔毛般的光泽。,转基因食品,“分子生物学研究方法”思考题：1、常用的核酸的凝胶电泳是哪两种？它们分辨DNA片段的范围有何不同？2、核酸的分子杂交的概念？Southern 印迹法、Northern 印迹法和Western 印迹法的检测对象分别是什么？3、PCR定义？简述聚合酶链式反应的基本原理？4、核酸测序的常用方法有哪些？5、列出用于基因克隆的主要工具酶。6、限制性核酸内切酶的命名原则。7、载体的概念。根据它的作用可分为哪两种类型？作为克隆载体必须具备的基本条件是什么？8、基因工程(重组DNA)的基本原理(主要步骤)？9、基因组文库(genomic library)的概念。cDNA文库的概念。10、怎样获得目的DNA片段？目的基因与载体的连接方式有哪些？11、目的基因的筛选和鉴定常用的遗传学检测法有哪些？,