《器官发生》PPT课件.ppt

第三章 细胞全能性与形态发生,细胞的全能性及其实现途径脱分化与再分化形态发生途径 器官发生途径 体细胞胚途径,前言：细胞全能性的实现,细胞实现全能性的过程：通过脱分化和再分化脱分化（dedifferentiation）：培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程。脱分化的结果：,愈伤组织 体细胞胚 转分化,第三节 形态发生途径,再分化（redifferentiation）：在离体条件下，当细胞脱分化以后，无序生长的细胞及其愈伤组织要重新进入有序生长进而才能再生个体，通常把离体培养下的这一过程称为再分化。生物个体形成：形态发生（morphogenesis）。（形态发生指由细胞再生植株的过程）,第三节 形态发生途径,器官发生途径体细胞胚发生途径,第三节(1)器官发生途径,主要内容：器官发生的途径（重点）器官分化的过程影响器官分化的因素（重点）,叶片,愈伤组织,（一）、器官发生方式,植物的离体器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器官的过程。器官发生的途径有两种：直接途径和间接途径。,1、器官发生途径,直接途径：不经愈伤组织阶段直接分化器官外植体中存在器官原基 如芽原基 外植体中不存在器官原基：如非洲紫罗兰叶片培养时，由叶 肉细胞直接再生芽。间接途径：经过愈伤组织阶段（多数）,1、器官发生的途径,间接途径（经过愈伤组织阶段）有3种方式：,2、器官分化过程,由愈伤组织再分化器官一般要经过3个阶段：(1)愈伤组织形成：脱分化阶段 细胞近圆形具液泡(2)生长中心形成：愈伤中出现类似形成层的细胞群（生长中心），细胞体积小，液泡消失(3)器官原基、器官形成：生长中心的某些细胞分化为管状细胞进而形成维管组织，最后分化出器官原基,2、器官分化过程,3、器官分化的影响因素,起始材料对器官分化的影响激素对器官发生的影响培养条件对器官发生的影响,（1）起始材料对器官分化的影响,母体植物的遗传基础：不同种属、品种培养效果差异大（顽拗性）总体上说，被子植物比裸子植物容易培养，在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培养成功的报道最多。通常情况下，自然繁殖以无性繁殖为主的植物在培养条件下也有较强的器官分化的能力。,（1）起始材料对器官分化的影响,母体植物的遗传基础：基因型对于培养反应的差异，器官分化能力的差异大于愈伤组织诱导的差异。,（1）起始材料对器官分化的影响,外植体的类型(概念?)来源于生长活跃或生长潜力大的组织、器官的细胞更有利于培养。以幼嫩组织为材料无论是诱导还是分化均较容易。无性繁殖植物以自然繁殖器官为外植体更易成功。,（1）起始材料对器官分化的影响,外植体的类型：外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，甚至影响分化的程度和器官类型。,（2）、激素对器官分化的影响,离体培养下的器官分化在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素实现的。在众多的植物激素中，生长素与细胞分裂素是2类主要的植物激素，在离体器官分化调控中占有主导地位。生长素/细胞分裂素高 有利于根分化 生长素/细胞分裂素低 有利于芽分化 生长素/细胞分裂素平衡 利于愈伤组织形成,（2）、激素对器官分化的影响,离体培养中，外源激素在细胞内的吸收和代谢影响到激素的活性从而影响其培养效果。外源细胞分裂素被外植体吸收后，在细胞内被修饰和转化形成活化形式和钝化形式。(一般认为，细胞分裂素自由碱基形式是活性形式，而核苷形式为钝化形式。)生长素进入细胞后，一部分以游离状态存在（活性形式），另一部分则与氨基酸结合形成生长素氨基酸复合体（钝化形式）。结合氨基酸多为天门冬氨酸、谷氨酸。,（2）、激素对器官分化的影响,外源激素通过调节内源激素的平衡状态而控制器官发生，而不同材料由于基因型不同和生理状态不同具有不同的激素水平，因此组织培养中实验的重复性很重要。不能只借鉴别人的研究成果。,（3）、培养条件对器官分化的影响,基本培养基：目前已创有30种基本培养基，固态和液态培养效果有差异。光照：光照时间（周期）、光照强度、光质连续的光照有利于培养细胞维管组织的形成，而一定的昼夜光照周期则有利于极性建立和形态发生。烟草，红光利于生根，蓝光促进茎芽分化。温度：,（3）、培养条件对器官分化的影响,光照：光照对器官发生的调节可能与调节培养物的内源激素平衡有关，光照还可能影响生长素的信号转导系统，调整生长素的极性运输，从而引起器官分化。光质对器官分化的影响可能与光受体精确调节系统有关。培养条件下，光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光合产物。,（二）、体细胞胚发生途径,体细胞胚的概念体细胞胚的发生途径（方式）体细胞胚的特点体细胞胚形成的影响因素,1.体细胞胚的概念,概念：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。这一定义有以下几方面的界定：其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；其二，体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚；其三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径。,2.体细胞胚的发生途径（方式）,体细胞胚的发生首先在胡萝卜中发现，目前已在30多科80余种植物中有发现。直接途径间接途径,（1）、直接途径,直接途径：由外植体直接诱导分化形成。大多数外植体为 叶片，如山茶、槐树子叶培养；茎 如石龙芮；胚 如柑橘属植物珠心细胞,例：兰草叶片体细胞胚直接发生,1.诱导阶段,2.胚胎发育阶段,（引自Chen等,1999）,（2）、间接途径,、经过愈伤组织的胚胎发生,形成分为三个阶段：诱导愈伤组织形成 高浓度生长素诱导愈伤组织胚性化 需要降低生长素浓度体细胞胚形成 进一步降低,（引自Lin等，2000）,、经悬浮培养的体细胞胚发生,代表：胡萝卜形成过程悬浮系 胚性细胞团（两种细胞，胚性细胞表现为体积小、成簇存在、胞质稠密）胚胎发生培养基 外周细胞不均等分裂 靠近细胞团的大细胞形成胚柄类似物，远离细胞团的小细胞形成原胚。,（引自Choi等，1997）,例：胡萝卜体细胞胚发生过程,（3）、体细胞胚的特点,与器官发生形成个体的途径相比，体细胞胚发育再生植株有三个明显的特点：体细胞胚具有双极性（doulble polarity）；生理隔离（physiological isolation）现象：体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系较少，后期脱落。起源于单细胞，遗传稳定。嵌合体,器官发生途径与体细胞胚途径的比较,（3）、体细胞胚的特点,与合子胚比较：合子胚 体细胞胚胚柄 具有明显的胚柄 一般没有真正的胚柄子叶 规范（可以作为分类的依据）常不规范 体积 大 小贮藏物质 干物质多 少水分 少 多（不能有明显的脱水干燥过程）休眠 有 可直接形成植株,（3）、体细胞胚的特点,数量多 结构完整稳定性好,3.影响体细胞胚发生的因素,激素的调控作用,培养基及培养条件的影响,基因型的影响,3.影响体细胞胚发生的因素,（1）、激素的调控作用生长素对体细胞胚的形成有决定性的作用。Ribnicky等在胡萝卜上胚轴培养中证明，体细胞胚形成初期细胞内具有较高浓度的游离态生长素。水稻胚性细胞的诱导也证明，高浓度的2,4-D诱导细胞内IAA含量升高，当加入外源IAA或阻止细胞内IAA渗出而提高细胞内IAA含量时，均可促进胚性愈伤组织形成。,3.影响体细胞胚发生的因素,（1）、激素的调控作用生长素不仅影响体细胞胚的早期发生，同时也影响体细胞胚的后期发育。生长素对体细胞胚后期发育的影响是通过极性运输实现的。Liu等（1993）利用拟南芥幼胚培养体系，揭示了生长素极性运输由球形胚期的轴向对称转向心形胚期的两侧对称的过程。如果这一过程受阻，则导致子叶异常发育成筒状子叶，而不是正常的2个子叶。,3.影响体细胞胚发生的因素,（1）、激素的调控作用2,4-D是应用最为广泛的生长素。2,4-D的应用有着规律性的变化，首先是在较高浓度下诱导胚性细胞的形成，然后在降低2,4-D的浓度下产生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生长素有利于体细胞胚的继续发育。外源生长素的对体细胞胚产生和发育的调控是通过调节内源激素的合成、代谢、极性运输和平衡而起作用的。,3.影响体细胞胚发生的因素,（1）、激素的调控作用细胞分裂素：研究报道较少，但几乎所有的有关体细胞胚胎发生的培养基配方中，均有细胞分裂素的配合使用。细胞分裂素在促进细胞分裂，维持细胞活跃生长中具有重要生理功能，而完成体细胞胚胎发育细胞分裂是基本前提，当胚胎结构建立后，细胞分裂素对于维持分生组织正常发育具有重要作用。,3.影响体细胞胚发生的因素,（2）、培养基及培养条件的影响氮源：体细胞胚的产生要求培养基中含有一定浓度的还原态氮。Vesco和Guerra在Feijoa植物体细胞胚诱导的试验证明，培养基氮源影响体细胞胚的发生频率。在NH4+和NO3-（15:34）的培养基中，每个外植体的体细胞胚可达10个以上，而培养基只有NH4+或NO3-时，体细胞胚发生频率很低。一些氨基酸可以代替还原态氮的作用。,3.影响体细胞胚发生的因素,（2）、培养基及培养条件的影响无机盐：球形胚形成后，降低培养基无机盐浓度，可以显著促进体细胞胚的进一步发育。例：Choi等（2002）西伯利亚人参培养实验Lee等（2001）胡萝卜体细胞胚试验 表明当胚性愈伤组织形成后，在只含1/2MS无机盐浓度的培养基中，体细胞胚形成可以比在MS培养基中高34倍。,3.影响体细胞胚发生的因素,（2）、培养基及培养条件的影响糖浓度：体细胞胚发育后期降低蔗糖浓度，也有利于胚的继续发育和提高体细胞胚的成苗率。氧气：低O2利于体细胞胚形成（胡萝卜）,3.影响体细胞胚发生的因素,（3）、基因型的影响,（引自Seabrook和Douglass，2001）马铃薯不同基因型体细胞胚形成能力比较,思 考 题,1、名词解释：脱分化、再分化、愈伤组织、体细胞胚2、形态发生的类型及其特点。3、影响形态发生的因素有哪些？,补充资料：离体培养下的遗传和变异,从对生物遗传的影响而言，细胞工程技术本身即包含了双重性：遗传稳定性和变异性。离体培养下变异的特点影响离体培养变异的因素体细胞变异的机制体细胞无性系变异的诱导和筛选,一、概念,Larkin和Scowcroft（1981）提出把由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系（somaclones），而把这些植株所表现出来的变异称之为体细胞无性系变异（somaclonal variation）。,二.离体培养下变异的特点,变异 的普遍性,变异的局限性,嵌合性,二.离体培养下变异的特点,1.变异的普遍性（引自李宝健和曾庆平，1990）,二.离体培养下变异的特点,2、变异的局限性就单个变异体来讲，离体培养中变异性状往往是单一的，或少数几个性状的变异。从表型上看，在不同植物类型中经常发生的变异主要是植株形态（株高、叶形、叶色等）、生长势、育性、某些抗性等性状的变异。从生理生化特性上看容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异。,二.离体培养下变异的特点,3、嵌合性嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组织培养中常见的现象。实际上，愈伤组织在大多数情况下是一种具有不同染色体数和遗传变异程度不同的细胞组成的嵌合体，这些细胞各自进行不同步的分裂。,三、影响体细胞遗传与变异的因素,供体植物,培养基和培养方式,继代培养的次数,三、影响体细胞遗传与变异的因素,1、供体植物供体植物的遗传背景对体细胞变异具有直接影响。供体植株原有的倍性水平在培养细胞多倍化过程中起着重要作用，处于二倍体水平上的细胞比处于单倍体水平上的细胞较为稳定。分生组织外植体再生的植株比分化组织外植体的稳定。植物种内基因型间变异频率差异较大。,三、影响体细胞遗传与变异的因素,2、培养基和培养条件培养方式、激素以及其它附加成分均会诱导体细胞变异的发生。激素：激素浓度和不同激素配比对再生植株的染色体倍性有一定影响。一些培养中还发现染色体倍性减少的现象。体细胞染色体减数与使用极端的激素浓度有关。,三、影响体细胞遗传与变异的因素,2、培养基和培养条件除了培养基的外源激素可以引起变异外，培养基的物理状态以及培养类型也会引起细胞的变异。一般来讲，悬浮培养的细胞较半固体培养的细胞易产生变异。原生质体培养的体细胞变异大于细胞培养的变异，而细胞培养的变异又大于组织器官培养的变异。,三、影响体细胞遗传与变异的因素,3、继代次数由继代次数引起的体细胞变异几乎在各种类型的植物中均有报道。一般来讲，继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的机率就越高。,四、变异的机制,DNA 重复复制,染色体断裂与重组,非正常有丝分裂,五、体细胞无性系变异的诱导与选择,体细胞无性系变异的表示方法主要有两种：一种是Chaleff提出的以R0、R1、R2、分别代表体细胞无性系变异的当代和自交以后的世代；另一种是由Larkin和Scowcroft提出的以SC1、RC2、RC3、来分别代表体细胞无性系变异的当代和自交以后的世代。,