《发酵工程下》PPT课件.ppt

,t1 t0 0.639G=n mm：比生长速率,在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时(Generation time)，通常以G表示，在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（Doubling time)。,纳米细菌（nanobacteria），三天才分裂一次；二十世纪九十年代初期从地下数公里发现的超微型细菌，用代谢产生的CO2作指标，计算出这些超微菌的代谢速率仅为地上正常细菌的10-15，有人认为它们需要100年才能分裂一次。,影响微生物增代时间（代时）的因素：,1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；,2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短,3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比，,凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物成分，就称为生长限制因子。,4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。,一个微生物细胞,合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。,如果同化作用的速度超过了异化作用,个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加,如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。,群体内各个个体的进一步生长,群体的生长,群体生长=个体生长+个体繁殖,个体生长 个体繁殖 群体生长,在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长）,微生物生长:,在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。,微生物生长的测定：,个体计数群体重量测定群体生理指标测定,评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；,评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；,客观地反映微生物生长的规律；,二、微生物生长的测定,稳定生长期(Stationary phase)：,由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。,稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。,细胞重要的分化调节阶段；储存糖原等细胞质内含物，芽孢杆菌在此阶段形成芽孢或建立自然感受态等。也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。,生产上为获得更多的菌体或代谢产物 1.补充营养物质或取走代谢产物 2.调节pH、温度 3.对好氧菌增加通气 4.搅拌或振荡等措施延长稳定生长期,衰亡期(Decline或Death phase)：,营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。,细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。,由于采用活菌计数比较麻烦，并要求严格进行操作，否则不易得到准确的结果，重复性也差，因此在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。,菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延缓期短；生理性状稳定；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；无杂菌污染；保持稳定的生产能力,种子的要求,四、工业微生物的扩大培养,、种子扩大培养的任务,得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。,对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数。,抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖较慢，常采用三级种子扩大培养；一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的也采用四级发酵如链霉素生产；有些酶制剂发酵生产也采用三级发酵；谷氨酸及其他氨基酸的发酵所采用的菌种生产繁殖速度很快，常采用二级发酵。,、种子制备的过程,种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的制备过程和在液体培养基中生产大量菌丝或营养体的种子制备过程。,（1）孢子制备（实验室种子制备）,孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。不同菌种的孢子制备工艺有不同的特点。,放线菌孢子的制备霉菌孢子的制备细菌培养物的制备,放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。碳源和氮源不要太丰富（碳源约为1，氮源不超过0.5），干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。放线菌斜面的培养温度大多数为28，少数为37，培养时间为514天。,1）放线菌孢子的制备,采用母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异；采用子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。,菌种接入种子罐有两种方法：,孢子进罐法将斜面孢子制成孢子悬浮法直接接入种子罐，可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工艺过程简单、便于控制孢子质量等优点；摇瓶菌丝进罐法适用于某些生长发育缓慢的放线菌，可以缩短种子在种子罐内的培养时间。,2）霉菌孢子的制备3）细菌培养物的制备,霉菌的孢子培养，一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。霉菌的培养一般为2528，培养时间为414天。,细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。细菌培养基温度大多数为37，少数为28，细菌菌体培养时间一般为12天，产芽孢的细菌需培养510天。,（2）种子制备（车间种子制备）,种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。种子制备所使用的培养基和其他工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。,1）摇瓶种子制备2）种子罐种子制备,某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，这就是摇瓶种子。摇瓶培养基配方和培养条件与种子罐相似。常采用母瓶、子瓶两级培养。种子培养基要求比较丰富和完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓，子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近于种子罐的培养基配方。,种子罐种子制备的工艺过程因菌种不同而异，一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。种子罐的级数主要决定于菌种的性质和菌丝生长速度及发酵设备的合理应用。,、种子培养,工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型。静置培养 即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。通气培养法 的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称好气培养法。,种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条件和培养方法，从而保证种子正常生长。,（）表面培养法（）固体培养法（）液体深层培养,表面培养法是一种静置培养法。针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固体表面培养。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液界面向培养基内传递。这种方法菌的生长速度与培养基的深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度越快。,固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称为曲法培养。起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。最大特点是固体曲的酶活力高。,液体深层种子罐从底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。该法容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基中氢离子等条件，选择最佳培养条件。,1）深层培养基本操作的三个控制点,灭菌温度控制通气、搅拌,发酵工业要求纯培养，因此在种子培养前必须对培养基进行加热灭菌。种子罐具有蒸汽夹套，以便将培养基和种子罐进行加热灭菌，或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌，并连续输送至种子罐内。,培养基灭菌后，冷却至培养温度进行种子培养，由于随着微生物生长和繁殖会产生热量，搅拌也会产热，所以要维持温度恒定，需在夹套中或盘管中通冷却水循环。,空气进入种子罐前先经过空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进入，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间，可再罐内装挡板产生涡流。搅拌底目的除增加溶解氧以外，可使培养液中的微生物均匀分散在种子罐内，促进热传递，以及pH均匀，并使加入的酸和碱均匀分散等。,2）几种深层培养,控制培养法载体培养法两步法,根据罐内部的变化情况，掌握短暂时间内状态变量的变化以及可能测定的环境因子对微生物代谢活动影响，并以此为基础进行控制培养，以达到产物的最优培养条件。电子计算机控制培养：用测定状态变量的传感器取得数据，经电子计算机进行综合分析，再将结果作为反馈调节的信号，将环境（培养条件）控制于给定的基准内。目前已大量用于露天大罐啤酒发酵。,载体培养法脱胎于曲法培养，同时吸收了液体培养的优点，是近年来新发展的一种培养方法。以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固体基质作为微生物的载体，营养成分可以严格控制。发酵结束后，只要将菌体和培养基挤压出来进行抽提，载体可重新使用。,在酶制剂的两步法液体深层培养中，每一步菌体相同而培养条件不同，因为微生物生长与产酶的最适条件由很大差异。菌体先在丰富的培养基上大量繁殖，然后收集菌体浓缩物，洗涤后再转入添加诱导物的产酶培养基，在此期间，菌体积累大量的酶，一般不再繁殖，营养成分或诱导物得到充分的利用。,、种子质量的控制,种子质量是影响发酵生产水平的重要因素。种子质量的优劣，主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件两个方面。,（）影响孢子质量的因素及其控制,）培养基）培养温度和湿度）培养时间和冷藏时间）接种量,构成孢子培养基的原材料，其产地、品种、加工方法和用量对孢子质量都有一定的影响。水质的影响也不能忽视。斜面培养基所用的主要原材料，糖、氮、磷含量需经过化学分析及摇瓶发酵试验合格后才能使用。供生产用的孢子培养基或作为制备砂土孢子或传代所用的培养基要用比较单一的氮源，以便保持正常菌落类型的优势。作为选种或分离用的平板培养基，则需要采用较复杂的有机氮源，目的是便于选择特殊代谢的菌落。,一般来说，提供培养温度，可使菌体代谢活动加快，缩短培养时间。不同菌株要求的最适温度不同，需经实践考察确定。一般来说，真菌对湿度要求偏高，放线菌对湿度要求偏低。,孢子的培养时间应控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。冷藏时间宜短不宜长。,制备孢子时的接种量要适中，接种后菌落均匀分布整个斜面，隐约可分菌落为正常接种量。一般传代用的斜面孢子要求菌落分布较稀，适于挑选单个菌落进行传代培养。,（）影响种子质量的因素及其控制,）培养基）培养条件）种龄,种子的质量是发酵能否正常进行的重要因素之一。,培养基的营养成分应适合种子培养的需要，一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，在营养上易于被菌体直接吸收和利用，营养成分要适当的丰富和完全，氮源和维生素含量较高；培养基的营养成分要尽可能和发酵培养基接近，以适合发酵的需要，这样种子移入发酵罐后能比较容易适应发酵罐的培养条件。培养基的pH要比较稳定，适合菌的生长和发育。,种子培养应选择最适温度，培养过程中通气搅拌的控制很重要。,种子培养时间称为种龄。在工业发酵生产中，一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。最适种龄因菌种不同而有很大差异。细菌的种龄一般为724h，霉菌种龄一般为1650h，放线菌种龄一般为2164h。,制霉菌素发酵的接种量为0.11；肌苷酸发酵接种量为1.52；霉菌的发酵接种量一般为10；多数抗生素发酵接种量为715，有时可加大到2025。,）接种量,移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例接种量发酵罐的接种量的大小与菌种特性、种子质量和发酵条件等有关。不同的微生物其发酵的接种量是不同的：,）种子质量的判断,细胞或菌体生化指标产物生成量酶活力,菌体形态可通过显微镜观察来确定。以单细胞菌体为种子的质量要求菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列和形态。以霉菌、放线菌为种子的质量要求是菌丝粗壮，对某些染料着色力强、生产旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。,种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH值变化,种子应确保无任何杂菌污染,菌种生长缓慢或过快菌丝结团菌丝粘壁,）种子的异常状况,与孢子质量和种子罐的培养条件有关。生产中通入种子罐的无菌空气温度较低或培养基的灭菌质量较差。因此生产中培养基灭菌后需取样测定其pH值，以判断培养基的灭菌质量。,与搅拌效果差、接种量小有关,在种子培养过程中，由于搅拌效果不好，泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因，使菌丝逐步粘在罐壁上，结果使培养液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。,5、种子质量的控制措施,种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中表现出来的生产能力。,（1）菌种稳定性检查：取少许保藏菌种用无菌生理盐水逐级稀释（稀释度以长成的菌落不至过密为宜），划线培养。挑出形态整齐、孢子丰满的菌落进行摇瓶试验，测定其生产能力，以不低于其原有的生产活力为原则，并取生产能力高的菌种备用。,（2）无（杂）菌检查：在种子制备过程中每移种一步均需进行杂菌检查。方法有：种子液显微镜观察，肉汤或琼脂斜面接入种子液进行无菌试验，种子液的生化分析。,种子液生化分析项目：营养消耗速度、pH变化、溶解氧利用情况、色泽、气味等。,（3）提供合适的培养条件：包括营养成分、温度、通气、pH等。以期获得优良种子。,本章要求,熟悉工业发酵常用微生物种类掌握菌种分离、筛选和选育的方法掌握常规的菌种保藏方法熟悉种子扩大培养的程序掌握种子扩大培养方法和质量控制方法,前面已讲完,