《发酵工业培养基》PPT课件.ppt

工业发酵培养基,多,快,好,省,碳源,氮源,矿质养分,生长因子,水,前体,活性物质,固态发酵,液态发酵,半固态发酵,斜面培养基,种子培养基,发酵培养基,分批灭菌,连续灭菌,组成确定,5点注意事项,对底物的利用速率,C/N,浓度,pH,原料,第4章：发酵工业培养基 4.1 发酵工业培养基概述 一.概念 1.培养基 提供微生物生长、繁殖及代谢需要的营养基质。2.发酵工业培养基：能用于工业生产的微生物培养基二.确定培养基组成的原则！有利于细胞快速繁殖；有利于积累大量的发酵产物。三.培养基的成分、配比对发酵的影响 1.微生物生长：2.发酵产品的生物合成量、速度及提取的难易程度：3.产品的产量、质量：,4.2 发酵生产的培养基类型 根生产工艺的要求及用途可分为3类：一.斜面培养基 1.作用：供菌种活化、保存、繁殖用。2.对斜面培养基的要求：使菌体生长快、繁殖快、健壮；不易引起菌种变异。3.组成特点：C、N源物质：不宜过多，尤其是C源，多了易引起pH波动；无机盐浓度：亦要适当控制，以免引起菌种特性变化。,二.种子培养基1.制备发酵“种子”（发酵剂）的目的提高发酵罐的利用率：为了增加发酵罐的接种量，往往先将斜面菌种在种子罐中繁殖到一定数量，以缩短菌体在发酵罐内生长繁殖所需时间，缩短延滞期，提高发酵罐的设备利用率。2.发酵级数菌种从种子罐到发酵罐扩大的次数。二级发酵1个种子罐+个发酵罐；三级发酵个种子罐+个发酵罐；在三级发酵中，将小种子罐（一级种子罐）的菌剂接入到较大的二级种子罐中培养，繁殖后再接入发酵罐中。,3.设计发酵级数依据的3大原则：菌种的性质（孢子数、孢子发芽率及生长率）：单位体积或重量的孢子浓度大、发芽快、生长快的菌种，发酵级数少，否则，级数多；发酵罐中种子的最低接种量：接种量少者，级数少；否则，级数多（多次繁殖才能得到足够的接种量）；种子罐容积（V1）与发酵罐的容积（V2）比：容积差异或V2/V1比值愈大，级数愈多。,4.对种子的3大要求：纯：无杂菌；壮：健壮，活力旺盛，繁殖快；多：有足够的数量。5.对种子培养基成分的要求：目的：菌种繁殖快；数量多 丰富、完全、特异、浓度适当：繁殖快 易被菌体吸收利用：速效 尽量与发酵培养基接近：减少延滞期,“宾至如归”C/N控制合理：过大，产酸，pH稳定 非连动型产物之发酵：种子培养基不需添加形成产物所需前体等特殊物质,6.注意事项 种子扩大条件与发酵条件一致：种子培养基的主要成分和培养条件：应尽可能与发酵培养基及发酵条件一致，以减少菌种转入发酵罐后菌体为适应新环境而进行的酶诱导等生理适应，使菌种迅速转入旺盛生长繁殖；不考虑产物合成所需的特殊成分：对于非生长连动型产物的发酵，种子培养基不需要添加用于形成产物的前体等特殊物质（次生代谢产物形成所需的物质），以节约生产成本。只考虑细胞繁殖数量，不考虑产物合成,三.发酵培养基！用于发酵产品生产的培养基1.作用：两大功能.提供菌体生长繁殖所需各种营养成分：.提供发酵产品生物合成所需原料：2.要求能满足细胞快速繁殖的需要：短时间得到大量细胞培养基成分适当丰富、完全、具特异性：“因菌而异”适合于该菌种的生理特性，菌体生长、繁殖迅速、健壮，能在较短周期内得到大量的细胞数。含有目标代谢产物合成必需的前体、活性因子：培养基要适当丰富与完全：防止“大量速效养分抑制次级代谢产物合成”,3.目的“两快、两多”菌体：生长快而健壮，细胞数量多：目的：代谢产物合成速度快，数量多：,四.培养基类型的其他分法（一）.按纯度划分 1.合成培养基：生理研究，用化学试剂配；2.天然培养基：用植物、动物或微生物等天然有机材料或农副产品下脚料配制。发酵工业最重要 优点：“不纯”营养丰富：适于微生物快速生长繁殖与目的产物合成；不需另加微量元素、维生素：来源广泛，价格低廉：缺点：组分复杂，不易重复影响生产稳定性。,（二）.按状态分 1.固态：用途：菌种分离、保存；真菌子实体生产；真菌酶制剂生产；放线菌活菌制剂生产等 2.半固态：琼脂:0.5%0.8%。菌种鉴定：细菌“运动特征”观察；小曲酒生产：糖化、酒化并行；3.液体培养基：！发酵工业最重要的培养基，O2与养分传递容易。,4.2 发酵培养基原料设计工业发酵培养基组成时，除了营养要求外，还要考虑：原料来源与生产成本工业培养基原料选择3原则：A.营养特性：营养丰富 B.原料来源：来源广泛 C.生产成本：价格低廉原料类型：6种普通原料：碳源，氮源，矿质养分，生长因子；特殊原料：前体，活性因子,一、碳源及其主要功能（一）.生理功能 A.菌体生长、繁殖：提供碳源、能源 B.目的产物合成：提供C架、能源（二）.常用碳源 糖类（淀粉）油脂 有机酸 低碳醇等 在碳源严重缺乏时，Pr水解物AA亦可作为C源。工业发酵所用天然C源（玉米粉，薯干粉、野生植物淀粉、纤维及半纤维素等）中亦含有大量AA、维生素和矿质养分，即C、N、矿质养分同时存在,1.糖类 A.葡萄糖（G）：最易利用之糖，速效糖 注意两点副作用：产酸：G过多，呼吸作用过强，耗氧量过大，溶解氧不能满足需要，培养体系处于厌氧发酵状态：中间产物不能通过呼吸作用完全氧化，积累在菌体或培养基中，如丙酮酸、乳酸、乙酸等导致pH下降影响酶活性，抑制微生物生长与产物合成；“葡萄糖效应”：抑制次级产物合成！G分解产物阻遏或抑制某些目的产物合成所必需的酶的形成与酶的活性：导致某些次级代谢产物（抗生素等）不能合成,B.糖蜜！糖厂生产糖时的结晶母液，副产物，含有丰富的糖，氮素化合物，矿质元素，维生素，是发酵工业价廉物美的原料。糖蜜主要含蔗糖，含糖量达50%-70%（W/V）。糖蜜分为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两种，成分不同，使用时要查阅有关资料。糖蜜常用于酶母的酒精发酵、丙酮丁酮生产及抗生素发酵。,2.淀粉常用碳源，需水解为单糖后再利用。优点：克服G过多的两大缺点：代谢过快耗氧产酸；葡萄糖效应来源丰富，价格低：常用淀粉：玉米淀粉，小麦淀粉和甘薯淀粉。注意事项：培养基中淀粉含量大于22.0%时，易结块，应该先用淀粉酶糊化液化，然后再混合，配制、灭菌。含淀粉酶的微生物可直接利用玉米粉、甘薯粉、土豆粉。3.油与脂肪有的微生物含脂肪酶:油/脂肪+脂酶甘油+脂肪酸CO2+H2O+ATP,油脂作C源时，应注意下列问题：氧化分解时的耗O2量远大于糖为C源时的需O2量：若O2不足，形成厌氧发酵条件，代谢形成的有机酸积累，pH下降，影响微生物酶系作用。脂肪酸降解形成的“短链C架”可直接参与目的产物合成：提高发酵产物产量,4.有机酸有机酸盐作C源时，随C架氧化，pH上升。原因：CH3COONa+2O22CO2+H2O+NaOH不同C源在降解氧化时，对pH的影响不同：A.GpH下降：供O2不足条件下；B.油/脂pH下降：供O2不足条件下；C.有机酸盐pH上升：Na+OH-NaOH5.正烷烃：C14-C18：可用于有机酸、AA、维生素、酶制剂生产。但因成本等原因，尚未应用；能源危机，不能用。在不同C源上，细胞得率不同：细胞产量各种C源的化学组分，可查阅有关手册。,二、N源及主要功能 Pr、AA为主，其他为辅 N：构成菌体细胞物质（AA、Pr、核酸）；含N目的产物。A.菌体生长、繁殖所需N素：细胞建造；B.合成“目的产物”所需N素：产物成分 C.合成“目的产物”所需“前体、调节物”：有机N源在工业发酵培养基中十分重要！,1.有机N源.饼粉类：黄豆饼粉，花生饼粉，棉籽饼粉，玉米浆，蛋白胨，酵母粉，鱼粉，蚕蛹粉等。有机氮源物的组分：7种，蛋白质，AA，糖类，脂肪，无机盐，微量元素，生长素等，是微生物的良好营养物质。微生物在有机N源培养基中生长旺盛，菌丝浓度增长迅速。原因：微生物能“直接利用”有机N源中的AA；不同结构的C架.“半成品”；“预制件”合成所需Pr及其它细胞物质，而无需从糖代谢开始合成各种细胞物质。“坐享其成”,产地、加工方法均影响饼粉的物质组成：！低温压榨：40-50；中温压榨：80-90；高温压榨：100；溶媒浸出：玉米浆生产玉米淀粉、酒精发酵的副产物，其中固体含量达50%左右，还含有较多有机酸，pH4.0。良好N源，易被微生物利用。原因：含有丰富的AA、还原糖、有机酸、微量元素、生长素。其中的磷酸肌醇对促进红霉素、链霉素、青霉素、土霉素等合成有积极作用。玉米来源、加工方法不同，浆之化学成分不同,酵母膏、蛋白胨、鱼粉、蚕蛹粉，血粉：对不同微生物有不同的生物效应。影响：A.菌体形成；B.产物的数量与质量。实例：a.酵母膏：影响利福霉素合成能力；b.植物蛋白胨：提高“麦白霉素”生物合成量。c.玉米粉：含“柔红霉素”生物合成的诱导物。尿素：成分单一，无上述复杂有机N的作用。青霉素、谷氨酸发酵中常用，能使-酮戊二酸还原并氨基化，提高谷AA合成能力。AA：成本高，一般不作为N源用。,2.无机N源速效N源：化学肥料，铵盐，硝酸铵、氨水，易发生类似“G效应”的现象：速效N快速利用，形成的“代谢产物”阻遏/抑制了参与抗生素合成的有关酶的合成/活性，抗生素产量大幅度下降。,含氮生理酸碱性盐：引起pH变化 A.（NH4）2SO4：NH4+利用，SO4-2+2H+H2SO4,pH下降（生理酸性盐）B.NaNO3：NO3-利用 Na+OH-NaOH，pH上升（生理碱性盐）生理酸、碱性盐配合理使用：矫正pH，意义重大 实例：A.用曲霉制糖化酶：加NaNO3，菌体粗壮、培养时间短、糖化力高，酶活性强。,原因：曲霉产酸，Na+NaOH矫正，pH稳定。B.黑曲霉发酵制纤维素酶：加（NH4）2SO4，NH4+利用，SO4过剩，H2SO4pH下降抑制杂菌；糖化酶活力高。NH3H2O许多抗生素发酵中通NH3，注意：A.加NH3时防止局部过碱：少量多次，加强搅拌；B.过滤除菌：因为氨水中含有大量耐碱微生物 引起污染。,三.矿质养分略。CaCO3调pH！四.生长因子五.水质各地水质不一致；六.前体微生物合成目的产物必需的化学结构。该结构是目的产物分子结构的骨架或目的产物分子结构的一部分外源前体：菌体不合成；或合成少，不够用，需外源加入的化学结构内源前体：菌体细胞自身合成的化学结构,1.外源前体 产生菌不合成或合成极少，需由外源添加的、以供合成目的产物的化合物。培养基中需加入：实例：青霉素G/V合成：苯乙酸/苯氧乙酸。在青霉素发酵中，加玉米浆，青霉素产量提高5倍。原因：玉米浆中含苯乙酸等 2.内源前体 产生菌自身合成的、用于目的产物化学结构形成的化合物 实例：-氨基乙二酸、半胱AA、缬氨酸为青霉素、头孢霉素C合成的前体。目的产物“合成与否及产量高低”与“前体”密切相关：无前体，则目的产物合成如“无源之水”,七.活性物质需要量少，但作用明显的化学物质。1.刺激剂与其功能：机理不清，但效果明显。实例：甲硫AA、亮AA：对头孢霉素C合成影响很大-荼乙酸：金霉素、巴比妥链霉素2.抑制剂及功能：作用于酶：抑制一些途径、激活另一些途径，合成特定产物实例：亚硫酸氢钠（NaHSO3）：抑制乙醇合成，促进甘油合成青霉素：影响细胞壁合成通透性，提高谷AA产量；碱金属磷酸盐：抑制草酸形成，促进柠檬酸形成,3.诱导剂 次生代谢诱导：抗生素：A因子链霉素；B因子利福霉素 酶之诱导：诱导剂诱导酶；PrPr酶；纤维素纤维素酶；果胶果胶酶；淀粉淀粉酶。,4.促进剂 实例：生产红霉素：要加入正丙醇；生产核黄素：要加入丙酸盐；生产金霉素、灰黄霉素：要加入Cl元素等；青霉素G发酵时：加入玉米浆后产量从20g/ml增加到100g/ml；原因：玉米浆中含苯乙酸，胺，能被优先结合到青霉素分子中去，故可提高产量。生产青毒素G：加入苯乙酸；制备青毒素V：加入苯氧乙酸。注意：量多时有毒性，应流加。,4.3 发酵培养基原料预处理 发酵工业所用原料以农副产品和工业有机下脚料为主，为适于各种微生物利用，常需进行预处理。主要原料的预处理方法如下：一.淀粉 水解 淀粉短链糊精双糖单糖 水解方法：酸法、酶法，酸酶结合法。1.酸解 优点：水解速度快，应用普遍 应用：AA发酵，核苷酸发酵均采用此法。工艺流程：淀粉+水淀粉浆（18%-22%调淀粉浆pH=1.5水解（2.83.0kg/cm2,15-30min）水解糖液降温、中和，脱色，过滤糖液（含葡萄糖16%-18%，DE=90%-92%）,调浆：淀粉+水淀粉乳（含干淀粉18%-22%）加酸：HCl约为干淀粉的0.5%-0.8%（pH1.0-1.5）糖化：淀粉乳：加热（t糊化温度，防结块），温度低，色泽好 进料毕，升压至2.8-3.0kg/cm2,维持15-30min，使淀粉水解完全：糖液含G16%20%，糖液DE=90%-92%(糖化率)水解液后处理：糖液冷却至70左右，用纯碱中和至pH=4.0-4.5，使蛋白质和胶体沉淀完全；加0.1%活性碳脱色；60以上过滤。,注意事项：高温水解过程中常出现两种副反应：无效化 A.G的缩合反应：G重新缩合为二糖（龙胆二糖，-1，6键，异麦芽糖），这些糖为非发酵糖，微生物不能利用。B.G的脱水反应 生成5-羟甲基糠醛，再与氨基酸结合生成有色物质。上述副反应导致葡萄糖的无效化。,2酶法水解.反应 主反应：淀粉+淀粉酶系G 副反应：G+转葡萄糖苷酶异麦芽糖（非发酵糖）.淀粉酶系组成：4种酶A.-淀粉酶:打开-1，4键，任意内断B.-淀粉酶:打开-1，4键，二糖外断C.糖化酶：形成GD.异淀粉酶：打开-1，6葡萄糖苷键：上述酶互相配合，使淀粉彻底水解.淀粉酶产生菌：芽孢杆菌，霉菌 转G苷酶：有害酶,可形成异麦芽糖（含1，6键，非发酵糖），选育种时要设法避免。,A.-淀粉酶:名称：液化酶；任意内断型酶；产物光学构型为-型 作用：打开-1,4糖苷键 直链淀粉水解产物：将直链淀粉分子-1，4键任意地不规则地断开，形成若干个短链糊精；糊精继续分解13%G+87%麦芽糖,支链淀粉水解产物：a.任意、不规则断开-1，4键；b.不能分解-1，6键（可绕过-1，6键）：G+麦芽糖+糊精（少量）-淀粉酶:能迅速形成较多糊精，使淀粉醪液粘度快速下降，这种作用称为糊精化作用，或液化作用。产-淀粉酶的微生物：芽孢杆菌；曲霉中的一些种株。唾液、胰脏、麦芽里也含有-淀粉酶。,B.-淀粉酶：麦芽糖酶 功能：打开-1,4糖苷键，外切型淀粉酶：二糖外断型，每次切出个麦芽糖；直链淀粉水解产物：麦芽糖 支链淀粉水解产物：麦芽糖+界限糊精 在1，6键前可以分解成麦芽糖；遇到1，6键就无法使其分解；故遗留有1，6键的界限糊精；该酶从非还原性末端按“两个G”切断糖苷键不产G。-淀粉酶麦芽糖（即麦芽糖的半缩醛羟基是-构型的）；,产-淀粉酶的微生物：多粘芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，假单孢菌，土佐链霉菌，霉菌。甘薯，大豆，麦芽中含有丰富的-淀粉酶。C.糖化酶：功能：打开-1，4糖苷键，产生葡萄糖直链淀粉水解产物：G作用：每次切下一个“G”单元，生成G，不生成麦芽糖。对1，6键分解缓慢，但却能越过1，6键继续水解-1，4键。该酶也能分解麦芽糖产生微生物；黑曲霉、米曲霉,D.异淀粉酶：打开-1，6糖苷键（支链键）别名:解支酶，淀粉1，6葡萄糖苷酶：支链淀粉6-葡聚糖水解酶（界限糊精酶，R-酶）,能水解含1，6键的糊精而生成G。产生菌：酵母，细菌，霉菌。淀粉酶的性质：A.不同菌种，各种淀粉酶含量不同:米曲霉：-淀粉酶多，不耐酸，其它3种酶少；黑曲霉：-淀粉酶少，耐酸性强，其它3种酶多；枯草杆菌：-淀粉酶多，其它3种酶少；耐热（75105）B.同种酶，来源不同时，生化性质不同:如不同来源的糖化酶对淀粉的分解程度不同,非发酵糖的形成“葡萄糖转移糖苷酶”：可使G与G，或G与麦芽糖进行1，6键结合，生成异麦芽糖等非发酵糖。米曲霉含“G转移糖苷酶”；黑曲霉含少量该酶；根霉不含该酶。酶法水解淀粉的4大优点：A.专性强；B.水解完全，无副反应或很弱；C.水解液葡萄糖纯度高（浓度=25%30%，DE=98%）；D.效率高（比酸法高12%，比酶酸法高5%）；水解产物较多，酶本身为protein水解液营养丰富。3.酸酶法水解淀粉：先酸后酶；先酶后法。,二.纤维素中国：10亿t/a纤维物质；全球更多。少量作饲料，大量未开发。天然纤维素的平均分子量：615107；1.基本结构：原纤维微纤维束集合：1540根纤维分子长链=结晶部+非结晶部纤维分子整齐、规则排列而成，结晶部分较非结晶部分：更难分解。,天然纤维成分：纤维素50%60%：半纤维素21%24%,牢固结合层；木质素12%25%；天然纤维素难以分解的原因：木质素、半纤维素紧密包围纤维素，导致酶与纤维素难以接触，纤维素的酶解效果差。,要提高纤维素的糖化速度，必须：将天然纤维素粉碎:增加比表面，球磨机等，能耗高除去木质素：除掉纤维素外部“绝缘层”，使酶能与纤维素接触破坏纤维素的晶态结构：总目的：增加酶与纤维素的接触面除去木质素后，纤维素与酶的有效接触面积增大糖化明显加速糖化速度=f（结晶度，有效比表面，内部孔隙及其分布，聚合度等）。破坏纤维素的结晶构造，脱去木质素的预处理十分重要。,2纤维素原料预处理物理法：4种，粉碎；去掉由半纤维与木质素构成的外壳；多孔，易于酶解作用A.微粉碎 用球磨或碾磨将纤维素物质粉碎。然后再用纤维素酶处理。糖化效果与粉碎度有关。优点：粉碎的纤维粉末具膨润性，体积小，可以提高基质浓度高浓度糖化液。缺点：耗能多。,B.蒸煮用150200饱和水蒸汽处理1020min；使木质素的丙烯乙醚及部分-丙烯乙醚裂开；破坏木质素和半纤维素结合层。C.爆碎：“爆米花”采用物理法增大纤维素酶与纤维素的接触面。方法：几十个大气压+220240饱合水蒸汽骤然降压纤维素爆碎松散，孔隙增大。中国科学院过程研究所陈洪章：在山东进行秸秆纤维素燃料酒精发酵中试，用该法处理秸秆 D.微波处理300MHz300KMHz+密闭容器+210220：糖化率随温度升高。,化学处理酸、碱、有机溶剂、臭氧都有降低结晶度，溶解并脱去木质素之作用。有效的化学处理剂：NaOH,醇-NaOH，醇-酸，Na2S-NaOH(复合液处理效果最佳)；碱处理：降低结晶度；溶解木质素（类似造纸工业碱法处理）；问题：环境污染！解决方法：碱法造纸黑液生产腐殖酸！,微生物处理：效果不佳A.产木质素酶的微生物很多，但酶活低；B.白腐菌（木腐菌）分解木质素的能力较强白腐菌分泌的胞外氧化酶能将木质素分子的某些键打开。用白腐菌处理，节省能源，付产物可回收利用。缺点：A.培养时间长：B.纤维素降解：白腐菌还能产生纤维素酶、半纤维素酶，引起这两种物质部分损失。选育不产纤维素、半纤维素酶、只产木质素氧化酶的菌种是今后的选育目标。,3.纤维素糖化酶法糖化：纤维素酶：A.产纤维素酶的微生物：细菌、放线菌、霉菌及担子菌都能产生纤维素酶。产胞外纤维素酶的微生物：局限于木霉，黑曲霉，青霉等少数丝状真菌。B.纤维素酶；属多酶体系。目前已发现3种类型：C1酶：二糖外切，功能：打开-1，4糖苷键，从纤维素长链非还原性末端始，以纤维二糖为单位外切。类似淀粉酶中的-淀粉酶：二糖外切,Cx酶：相当于淀粉酶中的-淀粉酶 内切酶，任意内断型，将纤维素长链切断，形成短链 Cx酶可为C1提供更多的非还原必性末端。C1与Cx单独使用，活性较低，两者混用，活性提高-糖苷酶：相当于淀粉酶中的糖化酶 将纤维二糖水解为G，可解除纤维二糖对C1、Cx酶的反馈抑制。纤维素的糖化过程中。-糖苷酶的不足，往往成为糖化的限速因子。,C.纤维素酶的诱导不溶性纤维素是怎样完成诱导的尚不清楚。槐糖可诱导绿色木霉产生纤维素酶。试验表明：易代谢的碳源（速效C，包括G，蔗糖，淀粉等）阻遏纤维素酶合成。选育抗降解物阻遏突变株是提高产酶能力的好办法。,纤维素酶糖化时存在的问题纤维素酶糖化纤维素的最大困难：糖化速度“慢”原因：点 a.纤维素结构的难分解性：结晶；木质素=“绝缘层”解决：粉碎；碱处理 b.酶活性低：-糖苷酶活性最低 解决：高酶活菌种选育 c.纤维素酶易被降解物抑制：纤维二糖；G；木糖 当木糖浓度，对纤维素的抑制率达到10 解决：解除反馈抑制：混菌发酵,解决办法：解除纤维二糖、G及木糖引起的抑制作用的途径：设法“移走G”：降低水解液中小分子糖的浓度 实例：水解产糖-发酵耗糖同步进行 采用“糖化+发酵”工艺：在酒精发酵生产中，用发酵G形成乙醇的方法，降低糖化液中G。方法：酶法糖化之时，接入能利用木糖的菌株与酿酒酵母，降低木糖与G浓度，减少对纤维素酶的抑制，提高糖化效率。,问题：酶解温度和酵母菌发酵所需温度不一致。选育耐高温的酒精酵母。现已发现1株能在48生长的克鲁弗氏酵母菌，该菌的生长温度与纤维酶的最适水解温度（50）一致。,纤维素的酸法糖化：常用A.浓酸水解效果好，但要消耗大量H2SO4。少量浓H2SO4+干燥的植物原料混合碾磨碾磨物+H2O稀释煮沸糖液。100kg干木材+30kg H2SO4（85%）副反应：G+H2SO4乙酰丙酸，蚁酸G产率下降,B.稀酸水解 原料与酸接触面积愈大，水解效果愈好：原料必须粉碎 方法：稀酸常压水解：H2SO4：2%-5%稀酸加压水解：H2SO4：0.5%-1.0%水解液成分：14种：戊糖；已糖；糠醛；萜烯；甲醇；甲醛；甲酸等挥发物；腐植质；木质素；树脂酸；另外，还有单宁、糠醛酸、植物性甾醇等非挥发性有机物，游离H2SO4，水解结束要中和游离酸，除去挥发成分。,水解液之处理：a.中和：加石灰乳至pH=4.5-5.2 b.通风：维持水解液在80-86，通风1h与驱除醛类等挥发性物质；促使胶体下沉。c.调pH：加石灰乳至pH=6.5-6.8静置澄清（保持温度80）。d.加FeSO4：除去单宁及其衍生物。酶解与酸解结合 将纤维素溶于磷酸溶液，再用固定化纤维酶处理G；,三.其它原料 除去不利于微生物生长利用之物。1.糖蜜 糖蜜成分：糖+杂质（妨碍微生物生长繁殖），故发酵前须进行预处理,使废糖蜜澄清.方法:压滤法等 2.亚硫酸纸浆废液 戊糖+已糖，也含有SO2、H2SO3及糠醛（必须除去）。用途：单细胞蛋白饲料，白地霉等 处理方法：,A.驱除挥发性有机杂质：通风12h，则可驱5687%SO2，3541%糠醛，43%71%甲醇，4564%有机挥发性酸。B.调pH：pH=4.55.0，保温80；C.除单宁：加FeSO4D.调pH 6.56.8：加石灰乳，维持8085，使醛基和H2SO3结合的化合物分解，并加入（NH4）2SO4。E.静置24h：吸取上清液，过滤后冷却备用【碱法造纸黑液：制造腐殖酸】3.酒糟 酸水解液，含有戊糖、已糖，糠醛、有机酸和单宁等，去杂方法与上相同。,4.4 影响培养基质量的因素一.原料质量 1.产地、品种：植物性原料，动物性原料：2.加工方法：冷，热饼粉 3.贮存时间：新，陈二.水质 深井，地表，自来水，纯水,三.灭菌方式 1.现象：实罐（大罐）灭菌、摇瓶灭菌，接入相同种子，大罐发酵产量远低于摇瓶。2.原因：实罐灭菌：破坏养分产量下降 大罐灭菌营养成分破坏多、形成副产物：时间长、局部过热，糖类易被破坏；Ca+HPO4=CaHPO4 还原糖+AA+肽+Pr羟甲基糠醛和类黑精（棕色）产生有毒物质：影响抗生素合成。“毒素”为何成分，尚不清楚,四.其它 1.pH：对菌体代谢影响极大，影响酶活性 2.粘度：影响 A.溶O2量：B.产品提取、精制：C.搅拌：,4.5 发酵工业培养基配制原则与注意事项一、培养基组成的确定原则 1.确定培养基的成分范围：据现有生化、细胞学、微生物、发酵原理等 2.单因子试验：对C、N、无机盐、前体等因子进行逐个单因子试验，观察各个单因子的影响（对前体、对产物）有效因子；,3.多因子正交试验：多因子正交试验优化方案 影响菌体生长、产物合成的7种因子：A.培养基组分；B.灭菌中组分的破坏；C.组分配比；D.缓冲能力；E.粘度；F.灭菌方法；G.原料杂质等 目前尚不能通过理论推算进行培养基设计，只能通过生化、细胞生物学、微生物学等理论参照前人的经验配方，结合菌种、产物特性，通过单因子、多因子试验得到最优方案,二.注意事项！百年发酵工业经验及有关理论提示，设计发酵工业培养基时应考虑5个问题。1.微生物对底物的利用速率C、N源速效C/迟效C合理配合；速效N/迟效N合理配合；发挥各自优势，“扬长补短”。防止“G效应”对“目的产物”合成的影响。,产孢子培养基 注意：速效/迟效的比例；迟效养分要多 A.养分形态：养分丰富（尤其有机N源），速效：只长菌丝，不产孢子。养分相对贫瘠，迟、难效态：产孢。B.无机盐：要适量，否则，影响孢子量、颜色。实例：米曲霉，加草木灰，孢子繁茂，绿色。,2.微生物对C/N的要求 C/N：对细胞生长繁殖、产物合成影响极大，直接影响菌体生成，产物合成。N多：菌体生长旺盛，pH过高产物积累差；N少：菌体繁殖量不足，产物合成少?C多：pH过低，产物少。C少：菌体少，衰老快、自溶：营养不足产物少 过多、过少，产物都少，原因？,微生物对C/N的要求随生长阶段不同而异：繁殖阶段：C/N=25:1，但仅能维持细胞生长、繁殖，无过量代谢产物形成 代谢产物合成阶段：细胞要超量合成各种代谢 产物，要追加更多的C、N。不同代谢产物中的C、N含量不同，产物合成阶段的C/N不同：产物含N，要多加N；产物含C，要多加C；,A.发酵产物不含氮：C/N很大如柠檬酸合成：产物中无N：C/N=500/1-50/1 B.发酵产物含氮：C/N小 如谷AA发酵：需N多，C/N=5/1，若C/N=500/1-50/1，只长菌体，不产谷AA 结论：工业发酵培养基 C/N：随发酵产物种类而异3.微生物对pH的要求 牢记：发酵体系中的pH是动态的，时刻在变动 生理酸、碱性物质搭配使用：pH缓冲剂：CaCO3加入。中间补料调pH：加酸、加碱。,4.培养基各成分的浓度 浓度对目的产物的影响：高浓度的负效应：4种，渗透压增大；“葡萄糖效应”；溶氧量下降；搅拌阻力增大 适合的浓度：按经验、摇瓶和小罐试验结果综合考虑决定 实例：红霉素发酵中，淀粉多，能延缓菌丝自溶，提高发酵单位。但大规模发酵时，淀粉多，发酵液粘稠，产生下列问题：A.O2溶解、传递受阻：产物合成 B.产品提取困难：C.搅拌阻力大：故淀粉浓度要通过试验，达到一个合理的水平。,“稀配方”的优点：4 成本低：O2溶解、传递佳：易提取：易灭菌：浓度对孢子形成的影响 贫瘠：产孢。丰富：长菌丝，不产孢子。5.原料质量稳定性 成分稳定连续稳定、高产。原料采购、加工要注意：更换原料要做试验，不能随意更换：！,4.6 培养基的灭菌一、灭菌方式 1分批灭菌：也称“实罐灭菌”，适于规模小的工厂与种子罐灭菌，与分批发酵配合。A.定义 培养基在发酵罐中用蒸气加热，达预定温度且维持一定时间后，从夹套或蛇型管通入冷凝水，迅速将培养基冷却，并通入无菌空气保压，至接近发酵温度时接种发酵。“灭菌、冷却、发酵三位一体”,B.优缺点 优点：不需另外的灭菌设备，发酵罐与灭菌罐共用；操作简单。缺点：加热、冷却所需时间较长，降低发酵罐的利用率。大发酵罐不能用该工艺灭菌：原因 发酵罐本身的夹套和蛇型管传热面积面有限，难以实现“高温短时”的灭菌要求。,2连续灭菌 适于大规模工厂和大型发酵罐，与连续发酵配合 A.定义 培养基在通过发酵罐外高温“连消塔”的流动中瞬时完成灭菌过程；再经过一定时间的维持和冷却，最后进入发酵罐。特点：液体培养基在流动中完成灭菌过程“边走边唱”；“边流动，边灭菌”“灭菌、冷却、发酵分别在三个不同设备中进行：连消塔-冷凝器-发酵罐”,B.优缺点:4大优点 可实现“高温瞬时”灭菌：物料受热时间短，营养成分破坏少，可提高生产率 减少灭菌时间：该法总耗时分批灭菌法。可缩短生产周期，提高发酵罐利用率 蒸气负荷均衡，锅炉效率提高：便于自动控制：,该法3大缺点：易产生泡沫：灭菌培养基进入发酵罐时产生；培养基局部灭菌不彻底：时间短，传热慢 易发生道管堵塞：发生于粘度大或颗粒状物料的灭菌 克服：粘度不能太大；颗粒细小,二.影响培养基灭菌效果的几个因素1.温度与时间“高温瞬时”灭菌效果好，养分损失少：连续灭菌工艺可达到高温瞬时,2杂菌数量 灭菌时间取决于物料中的杂菌数量：杂菌愈多，所需时间愈长实例：肉毒梭菌数量与灭菌时间，105 高温长时间灭菌会使培养基中的营养成分遭到一定程度的破坏，甚至产生一些妨碍微生物生长代谢的产物。解决方法：注意原料质量，杂菌尽量少。另外，霉变原料中本身就有毒素，不能用作发酵原料！,3.培养基pH 实例：酸性土壤、中性土壤灭菌效果不同 灭菌时间取决于pH：pH6.0-8.0：微生物最耐热，不易死亡；pH6.0：H+易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理状态，促使其死亡。4.培养基成分 高浓度有机物降低灭菌效果：应提高灭菌温度。培养基中所含一定浓度糖类、油脂和蛋白质：增加微生物的耐热性。机理：高浓度有机物增加培养基粘度，影响热量传递。高浓度的盐类：促进灭菌 增加渗透压，促进热的传导，降低微生物耐热性,5.培养基中的颗粒大颗粒和结块基质的传热效果差，灭菌较困难。采用4大措施：原料充分磨细：愈细愈好，灭菌效果取决于物料细度灭菌前应充分搅拌：提高灭菌温度：延长灭菌时间：6.泡沫培养基灭菌时产生泡沫，泡沫中的空气形成隔热层，空气导热差，包裹在泡沫中的微生物不易被杀死（达不到致死温度）。灭菌操作中要注意泡沫产生，防止压力聚降而起泡。,