《反胶束萃取》PPT课件.ppt

第八章 反胶束萃取,传统的分离方法(如溶剂萃取技术)难以应用于蛋白质的提取和分离。其主要原因有两个：一是被分离对象蛋白质等在40-50便不稳定，开始变性，而且绝大多数蛋白质都不溶于有机溶剂，若使蛋白质与有机溶剂接触，也会引起蛋白质的变性；,第八章 反胶束萃取,二是萃取剂问题，蛋白质分子表面带有许多电荷，普通的离子缔合型萃取剂很难奏效。因此研究和开发易于工业化的、高效的生化物质分离方法己成为当务之急。反胶束萃取法就是在这一背景下发展起来的一种新型分离技术。,第一节 概 述,一、反胶团(Reversed Micelles)两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。,第一节 概 述,二、反胶团的特异性功能：(1)具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能；(2)在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性的功能。,第一节 概 述,三、优点(1)有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；(2)分离、浓缩可同时进行，过程简便；(3)能解决蛋白质(如胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题；,第一节 概 述,(4)由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶；(5)反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。,第二节 反胶团的形成,一、反胶团的构造 1、胶团的形成 向水溶液中加入表面活性剂，当表面活性剂的浓度超过一定的数值时，表面活性剂就会在水相中形成胶体或微胶团，它是表面活性剂的聚集体。,第二节 反胶团的形成,将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度(CMC)时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体，在通常情况下，这种聚集体是水溶液中的胶束，称为正常胶束(normal micelle)。,第二节 反胶团的形成,在胶束中，表面活性剂的排列方向是极性基团在外，与水接触，非极性基团在内，形成一个非极性的核心、在此核心可以溶解非极性物质。,第二节 反胶团的形成,2、反胶团的形成 当向非极性溶剂中加入表面活性剂时，如表面活性剂的浓度超过一定的数值时，也会在非极性溶剂内形成表面活性剂的聚集体。,第二节 反胶团的形成,与在水相中不同的是，非极性溶剂内形成的表面活性剂聚集体，其疏水性的非极性尾部向外，指向非极性溶剂，而极性头向内，与在水相中形成的微胶团方向相反，因而称之为反胶团或反向胶团,第二节 反胶团的形成,图8-1是几种可能的表面活性剂聚集体的微观构造。在反胶团中有一个极性核心，。它包括由表面活性剂极性端组成的内表面、平衡离子和水。此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了“水池”(water pool)。,第二节 反胶团的形成,这个“水池”具有极性，可以溶解具有极性的分子和亲水性的生物大分子，而极性分子和/或亲水性的生物大分子也因此可“溶解”在非极性的有机溶剂中。,第二节 反胶团的形成,如蛋白质及其他亲水物质能够通过螯合作用进入此“水池”。由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。,第二节 反胶团的形成,二、表面活性剂 表面活性剂的存在是构成反胶团的必要条件。1、表面活性剂的组成 表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。,第二节 反胶团的形成,2、表面活性剂的种类（1）阴离子表面活性剂；（2）阳离子表面活性剂；（3）非离子型表面活性剂。它们都可用于形成反胶束。,第二节 反胶团的形成,3、常见表面活性剂 AOT、CTAB(溴代十六烷基三甲铵)、TOMAC(氯化三辛基甲铵)、PTEA(磷脂酰乙醇胺)，其中以AOT最为常用。而常用于反胶团萃取系统的非极性有机溶剂有环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油等。,第二节 反胶团的形成,（1）阴离子型 在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表面活性剂AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸2乙基己基磺酸钠，结构式见图。,第二节 反胶团的形成,第二节 反胶团的形成,这种表面活性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基团较小、形成反胶束时不需加助表面活性剂，并且所形成的反胶束较大，半径为170nm，有利于大分子蛋白质进入。,第二节 反胶团的形成,（2）阳离子型 CTAB(cetyl-methyl-ammonium bromide)溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴,第二节 反胶团的形成,DDAB(didodecyldimethyl ammonium bromide)溴化十二烷基二甲铵,第二节 反胶团的形成,TOMAC(triomethyl-ammonium chloride)氯化三辛基甲铵,第二节 反胶团的形成,将阳离子表面活性剂如CTAB溶于有机溶剂形成反胶束时，与AOT不同，还需加入一定量的助溶剂(助表面活性剂)。这是因为它们在结构上的差异造成的。,第二节 反胶团的形成,二、反胶团的物理化学特性及制备1反胶团的物理化学特性 反胶团的大小与很多因素有关，如表面活性剂和非极性有机溶剂的种类、浓度；操作时体系的温度、压力；微小水池中的离子强度等等。,第二节 反胶团的形成,有机溶剂相中的反胶团一般比水相中微胶团的空间尺寸小得多，通常为球形，有些情况下也可能成为椭球形或棒形。,第二节 反胶团的形成,(1)反胶团的临界胶团浓度 将表面活性剂在非极性有机溶剂相中能形成反胶团的最小浓度称为临界胶团浓度(Critical Micelle Concentration，有时简称CMC)，,第二节 反胶团的形成,这是体系特性，与表面活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力等因素有关。在有机溶剂中反胶团的表面活性剂分子缔合数，与水溶液系统相比要小，而且疏水性的碳链越长缔合数越小。,第二节 反胶团的形成,CMC的数值可通过测定各种物理性质的突变(如表面张力、渗透压等)来确定。由于实验方法不同，所得的CMC值往往难于完全一致，但是突变点总是落在一个很窄的浓度范围内，故用CMC范围来表示更为方便。,第二节 反胶团的形成,反胶团不能理解为一成不变的刚性球，它的生成或解体、缔合数增大或减小以及各反胶团之间的相互作用速度很快，即反胶团的构成分子间能发生重组现象，其过渡时间很短，最大也仅为10-5 s。,第二节 反胶团的形成,(2)反胶团含水率W 反胶团的大小以及反胶团内微水相 的物理化学性质因反胶团含水率W的不同而差别很大。W用水 和表面活性剂的浓度之比来定义，即：,第二节 反胶团的形成,如表面活性剂是AOT，则：,W是个非常重要的参数，W越大，反胶团的半径越大。“水池”越大，“水池”大小与溶剂和表面活性剂的种类与浓度、温度、离子强度等因素有关，一般为520nm，其内水池的直径d用下式计算。,第二节 反胶团的形成,W 含水率（water content）;M，分别为水的相对分子质量和密度;surf 界面处一个表面活性剂分子的面积;N 阿佛加德罗常数 AOT在异辛烷中形成的反胶团直径(d)可用下述经验式推算 d=0.3W+0.24(nm),第二节 反胶团的形成,反胶团“水池”中的水与普通的水在性质上是有差异的。当W6-8时，微水相中的水分子被表面活性剂亲水性基团强烈地束缚，其表观粘度可增大到普通水粘度的50倍，且疏水性非常强。,第二节 反胶团的形成,其冰点通常低于0。进一步的研究发现，这一部分水实际上起着使表面活性剂的亲水性基团水合化的作用。因为这一部分水被牢固地束缚着，所以粘度很大，流动性很差。,第二节 反胶团的形成,在AOT反胶团中，水合化一分子AOT需要6-8个水分子，而其他水分子则不受束缚，可与普通水一样自由流动，所以当W16时，“水池”中的水逐渐接近主体水相粘度，胶团内也形成二重电荷层,第二节 反胶团的形成,但即使当W值很大时，水池内水的理化性质也不能与正常的水完全相同，特别是在接近表面活性剂亲水头的区域内。见图8-3。,第二节 反胶团的形成,当蛋白质分子与反胶团直径相比大得多时(例如，当相对分子质量超过100200kD)，难于溶解到反胶团中。当反胶团的含水率W较低时，反胶团水池内水的理化性质与正常水相差悬殊。,第二节 反胶团的形成,第二节 反胶团的形成,2反胶团的制备 制备反胶团系统一般有以下三种方法：(1)注入法 将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有表面活性剂的非极性有机溶剂中去，然后进行搅拌直到形成透明的溶液为止。这种方法的过程较快并可较好地控制反胶团的平均直径和含水量。,第二节 反胶团的形成,(2)相转移法 将酶或蛋白质从主体水相转移到含表面活性剂的非极性有机溶剂中形成反胶团蛋白质溶液。,第二节 反胶团的形成,即将含蛋白质的水相与含表面活性剂的有机相接触，在缓慢的搅拌下，一部分蛋白质转入(萃入)有机相。此过程较慢，但最终的体系处于稳定的热力学平衡状态，这种方法可在有机溶剂相中获得较高的蛋白质浓度。,第二节 反胶团的形成,(3)溶解法 对非水溶性蛋白质可用该法。将含有反胶团(W3-30)的有机溶液与蛋白质固体粉末一起搅拌，使蛋白质进入反胶团中，该法所需时间较长。含蛋白质的反胶团也是稳定的，这也说明反胶团“水池”中的水与普通水的性质是有区别的。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,一、反胶团萃取原理 从宏观上看反胶团萃取，是有机相-水相间的分配萃取，和普通的液液萃取在操作上具有相同特征。微观上，如图8-4所示，是从主体水相向溶解于有机溶剂相中纳米级的、均一且稳定的、分散的反胶团微水相中的分配萃取。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,第三节 生理活性物质的分离浓缩,其特点是萃取进入有机相的生物大分子被表面活性分子所屏蔽，从而避免了与有机溶剂相直接接触而引起的变性、失活。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,pH、离子强度、表面活性剂浓度等(如表8-1所示)因素会对反胶团萃取产生影响。通过对它们的调整，对分离场(反胶团)-待分离物质(生物大分子等)的相互作用加以控制，能实现对目的物质高选择性的萃取和反萃取。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,第三节 生理活性物质的分离浓缩,另外，因有机相内反胶团中微水相体积最多仅占有机相的几个百分点，所以它同时也是一个浓缩操作。如后所述，只要直接添加盐类，就可能从已和主体水相分开的有机相中分离出含有目的物的浓稠水溶液，操作上非常简单。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,1、三元相图及萃取蛋白质 对一个由水、表面活性剂和非极性有机溶剂构成的三元系统，存在有多种共存相，可用三元相图表示，图是水AOT异辛烷系统的相图示例。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,第三节 生理活性物质的分离浓缩,从图中可知，能用于蛋白质分离的仅是位于底部的两相区，在此区内的三元混合物分为平衡的两相：一相是含有极少量有机溶剂和表面活性剂的水相；一相是作为萃取剂的反胶束溶液。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,这共存的两相组成，用系线(图中虚线)相连。这一体系的物理化学性质非常适合于萃取操作，因为界面张力在0.12mN/m范围内，密度差为10-20，反胶束溶液粘度适中，大约为1mPas这一数量级。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程，即在宏观两相(有机相和水相)界面间的表面活性剂层，同邻近的蛋白质发生静电作用而变形，接着在两相界面形成了包含有蛋白质的反胶束，此反胶束扩散进入有机相中，从而实现了蛋白质的萃取,第三节 生理活性物质的分离浓缩,2、蛋白质溶入反胶束溶液的推动力与分配特性（1）推动力 蛋白质溶入反胶束溶液的推动力主要包括表面活性剂与蛋白质的静电作用力和位阻效应。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,静电作用力：在反胶束萃取体系中，表面活性剂与蛋白质都是带电的分子，因此静电相互作用肯定是萃取过程中的一种推动力。,其中一个最直接的因素是pH值，它决定了蛋白质带电基团的离解速率及蛋白质的净电荷。当pHpI时，蛋白质呈电中性；pHpI时，蛋白质带正电荷；pHpI时，蛋白质带负电荷。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,即随着pH的改变，被萃取蛋白质所带电荷的符号和多少是不同的。因此，如果静电作用是蛋白质增溶过程的主要推动力，对于阳离子表面活性剂形成的反胶束体系，萃取只发生在水溶液的pHpI时，此时蛋白质与表面活性剂极性头间相互吸引，而pHpI时，静电排斥将抑制蛋白质的萃取；,第三节 生理活性物质的分离浓缩,对于阴离子表面活性剂形成的反胶束体系，情况正好相反。此外，离子型表面活性剂的反离子并不都固定在反胶束表面。改变水相条件(如pH值和离子种类及其强度等)又可使蛋白质由有机相重新返回水相实现反萃取过程。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,位阻效应 许多亲水性物质，如蛋白质、核酸及氨基酸等，都可以通过溶入反胶束“水池”来达到它们溶于非水溶剂中的目的。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,但是反胶束“水池”的物理性(大小、形状等)及其中水的活度是可以用W的变化来调节的，并且会影响大分子如蛋白质的增溶或排斥，达到选择性萃取的目的，这就是所谓的位阻效应。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,（2）反胶束萃取中蛋白质的分配特性蛋白质在两相间的分配系数,第三节 生理活性物质的分离浓缩,反胶束浓度M与表面活性剂浓度Ssurf的关系为,M=Ssurf/N(N为聚焦数),第三节 生理活性物质的分离浓缩,3、反胶束萃取蛋白质的动力学 研究萃取和反萃取过程的动力学可为人们提供界面作用机制，从蛋白质在两相间的扩散动力学，可找到萃取过程的控制步骤，对合理设计萃取系统和装置具有理论指导意义。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,（1）传递步骤 萃取过程 蛋白质在互不相溶的两相间的传递可分为三步：蛋白质从水溶液主体扩散到界面；在界面形成包容蛋白质的反胶束；含有蛋白质的反胶束在有机相中扩散离开界面。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,反萃取过程 反萃过程同样有三步：含有蛋白质的反胶束从有机相主体扩散到界面；包容蛋白质的反胶束在界面崩裂；蛋白质从界面扩散到水溶液主体。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,（2）动力学方程 蛋白质进入或离开反胶束相的传递通量可用下式计算：,萃取过程,反萃取过程,第三节 生理活性物质的分离浓缩,式中Kf、Kr分别为萃取及反萃取过程的表观传质系数；Cw、C0分别为水相和有机相中蛋白质浓度；m为萃取的分配系数；m为反萃取的分配系数；t为时间。可以通过实验求得传质系数，从总传质系数和分传质系数的大小可以判断过程控制的类型。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,（3）萃取和反萃取的过程控制 三种类型：反应(包括相内反应和界面反应)控制过程；扩散(或传质)控制过程；混合控制过程。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,萃取过程 速率是由扩散传输机制控制的。Dekker等在TOMAC反胶束萃取淀粉酶时，证实了萃取过程的速率决定于淀粉酶在水相边界层的扩散速度。蛋白质的大小、所带电荷种类和电荷密度对萃取的快慢有重大影响。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,在TOMAC/庚烷体系中萃取和反萃取苯丙氨酸的动力学特征时，通过对传递通量方程进行非线性回归分析计算，得到前萃取过程的界面反应动力学常数8000cm4/mol.min,误差率1000%。表明界面反应速度非常快，萃取过程由扩散控制。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,反萃取过程 主要由界面反应过程控制。增大离子强度，即增大了AOT反胶束的刚性和稳定性，使界面作用过程变慢，反萃速率降低。这说明了萃取与反萃取的控制过程是不同的。由于界面作用过程较慢，一般反萃取平衡所需时间要比萃取过程长。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,二、反胶团的溶解作用 由于反胶团内存在微水池，故可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子，为生物分子提供易于生存的亲水微环境。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,关于反胶团溶解蛋白质的形式，有人提出了四种模型，如图所示。(a)为水壳模型，蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁(表面活性剂)隔开；,第三节 生理活性物质的分离浓缩,(b)蛋白质分子表面存在强烈疏水区域，该疏水区域直接与有机相接触；(c)蛋白质吸附于反胶团内壁；(d)蛋白质的疏水区与几个反胶团的表面活性剂疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,第三节 生理活性物质的分离浓缩,表面性质不同的蛋白质可能以不同的形式溶解于反胶团相，但对于亲水性蛋白质，目前普遍接受的是水壳模型。因为许多实验数据均间接地证明了水壳模型的正确性。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,例如：(1)反胶团内酶的结构和活性与W值密切相关，说明酶对其周围存在的水层非常敏感；(2)反胶团内酶反应动力学行为与在正常的水相中相似，活性与pH的关系同样表现为钟状曲线。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,三、影响反胶束萃取蛋白质的主要因素 蛋白质的萃取，与蛋白质的表面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用，以及反胶束的大小有关。所以，任何可以增强这种静电作用或导致形成较大的反胶束的因素，都有助于蛋白质的萃取。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,只要通过对这些因素进行系统的研究，确定最佳操作条件，就可得到合适的目标蛋白质萃取率，从而达到分离纯化的目的。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,1、水相pH值对萃取的影响 水相的pH值决定了蛋白质表面电荷的状态、从而对萃取过程造成影响。只有当反胶束内表面电荷，也就是表面活性剂极性基团所带的电荷与蛋白质表面电荷相反时，两者产生静电引力，蛋白质才有可能进入反胶束。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,对于阳离子表面活性剂、溶液的pH值需高于蛋白质的pI值，反胶束萃取才能进行；对于阴离子表面活性剂，当pHpI时，萃取率几乎为零，当pHpI时，萃取率急剧提高，这表明蛋白质所带的净电荷与表面活性剂极性头所带电荷符号相反，两者的静电作用对萃取蛋白质有利。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,如果pH值很低，在界面上会产生白色絮凝物，并且萃取率也降低这种情况可认为是蛋白质变性之故。水相pH值对几种相对分子质量较小的蛋白质的萃取影响见图。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,对不同相对分子质量的蛋白质，pH值对萃取率的影响有差异性，当蛋白质相对分子质量增加时，只有增大(pH-pI)值的绝对值，相转移才能顺利完成。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,如-糜蛋白酶(相对分子质量为25000)的萃取率在pH值低于pI值2-4时达到最高，而牛血清蛋白(相对分子质量为68000)在相同的系统中根本不发生相转移。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,这种差异性可解释为：对于包含大蛋白分子的反胶束，其尺寸远大于“空核”的反胶束，萃取时势必要消耗较多的能量，这些能量只能通过较强的静电相互作用得到补偿。用调节pH的作用来增加蛋白质分子表面电荷的方法，正是达到增强静电作用的一条途径。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,对那些尺寸小于“空核”的反胶束中水体积的蛋白质，只要其所携带的净电荷与表面活性剂电性相反，萃取就能发生。蛋白质的相对分子质量Mr与(pH-pI)绝对值呈线性关系,这种关系，对阴离子及阳离子表面活性剂所形成的反胶束体系同样适用。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,2、离子强度对萃取率的影响 离子强度对萃取率的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用所决定的：a.离子强度增大后，反胶束内表面的双电层变薄，减弱了蛋白质与反胶束内表面之间的静电吸引，从而减少蛋白质的溶解度；,第三节 生理活性物质的分离浓缩,b.反胶束内表面的双电层变薄后，也减弱了表面活性剂极性基团之间的斥力，使反胶束变小，从而使蛋白质不能进入其中；c.离子强度增加时，增大了离子向反胶束内“水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向，使蛋白质从反胶束内被盐析出来；,第三节 生理活性物质的分离浓缩,d.盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用，可以改变溶解性能，盐的浓度越高，其影响就越大。如离子强(KCl 浓度)对萃取核糖酸酶a,细胞色素c和溶菌酶的影响见图,由图可见，在较低的KCl浓度下，蛋白质几乎全部被萃取，当KCl浓度高于一定值时,萃取率就开始下降，直至几乎为零。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,3、表面活性剂类型的影响:前面已经提到阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂都可用于形成反胶束。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,关键是应从反胶束萃取蛋白质的机理出发，选用有利于增强蛋白质表面电荷与反胶束内表面电荷间的静电作用和增加反胶束大小的表面活性剂。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,还应考虑形成反胶束及使反胶束变大(由于蛋白质的进入)所需的能量的大小、反胶束内表面的电荷密度等因素，这些都会对萃取产生影响,第三节 生理活性物质的分离浓缩,4、表面活性剂浓度的影响 增大表面活性剂的浓度可增加反胶束的数量，从而增大对蛋白质的溶解能力。但表面活性剂浓度过高时，有可能在溶液中形成比较复杂的聚集体，同时会增加反萃取过程的难度。因此，应选择蛋白质萃取率最大时的表面活性剂浓度为最佳浓度。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,总结反胶束体系对核糖核酸酶a与伴刀豆球蛋白进行萃取的结果，得到了分配系数K同表面活性剂浓度S以及pH值的关系式：1nKA十B*pH十(C十D*pH)lnS 式中系数A、B、C、D取决于蛋白质的性质，可通过实验测定。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,5、离子种类对萃取的影响 阳离子的种类对萃取率的影响主要体现在改变反胶束内表面的电荷密度上。通常反胶束中表面活性剂的极性基团不是完全电离的，有很大一部分阳离子仍在胶团的内表面上(相反离子缔合)。极性基团的电离程度愈大，反胶束内表面的电荷密度愈大，产生的反胶束也愈大。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,6、影响反胶束结构的其他因素（1）有机溶剂的影响:有机溶剂的种类影响反胶束的大小，从而影响水增溶的能力，所以可以利用因溶剂作用引起的不同胶束结构实现选择性增溶生物分子的目的，如-胰凝乳蛋白酶随溶剂的不同在反胶束中增溶的比率会出现显著的差别。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,（2）助表面活性剂的影响:当使用阳离子表面活性剂时，引入助表面活性剂，能够增进有机相的溶解容量，这多半是由于胶束尺寸增加而产生的。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,（3）温度的影响:温度的变化对反胶束系统中的物理化学性质有激烈的影响，增加温度能够增加蛋白质在有机相的溶解度，例如增加温度可使-胰凝乳蛋白酶进入NH4-氯仿相并在转移率上分别增加50。,第三节 生理活性物质的分离浓缩,第四节 在分离工艺中的应用,利用图8-8和图8-9的静电相互作用，通过三步分离操作(图8-13)，分离了核糖核酸酶a，细胞色素c和溶菌酶。调整pH，进行正萃取分离，通过控制KCl浓度，反萃取分离，能获得较好的分离效果和收率。通过立体性相互作用(图8-12)和静电相互作用的组合，三步能分离溶菌酶、-胰凝乳蛋白酶和BSA。,第四节 在分离工艺中的应用,使用如图8-14所示二级混合分离型萃取流程，用TOMAC0.1(体积分数)辛醇异辛烷的溶液体系连续分离。淀粉酶，控制第一级水相中酶浓度在较低水平上，使失活速度很小，第二级水相中酶的回收率为84，浓缩了17倍。,第四节 在分离工艺中的应用,分离膜型的液液反胶团萃取是上述混合分离型的改进型，以疏水性多孔质膜(接触比表面积较大，30300cm2cm3)作为液液两相的接触界面，如在聚丙烯中空膜组件的内外两侧，分别流过含有蛋白质的水相和含有反胶团的有机相(AOTn-辛烷)。,第四节 在分离工艺中的应用,调整内外两侧的压力差，防止膜面乳浊液的生成，以保持液液界面。在这种场合下，因膜自身对蛋白质透过无选择性，可以认为和一般的反胶团萃取分离法具有相同原理。,第四节 在分离工艺中的应用,这种方式的一个大的优点是，没有在一般连续性液液萃取法中成为问题的进料和液泛等制约因素，可自由地改变液流的流速。总物质移动速度和膜面积也比一般方法大，另外在原理上是连续式的，放大也较容易等。,第五节 反胶束萃取的应用,一、反胶束萃取蛋白质的应用1、同时提取蛋白质和油脂:在AOT-异辛烷反胶束同时萃取花生蛋白和花生油的过程，讨论了影响萃取的主要因素，得到了最佳萃取工业条件。萃取后，油进入有机相，而蛋白质溶入反胶束中。克服了传统方法工艺复杂,得率低,蛋白质容易变性的缺点同时用蒸馏方法将油和烃分开,提炼出了油脂,2、分离蛋白质混合物:Chang在Aliquat336/异辛烷反胶束分离枯草杆菌中两种酶和淀粉酶和中性蛋白酶时，通过加入助表面活性剂丁醇,有效地分离了这两种不同等电点的酶。,3、从发酵液中分离和提纯酶:Krishnakant用AOT/异辛烷体系从土豆发酵液中提取酸性磷酸酶,在pH值810,萃取水相与有机相体积比为3B1,反萃水相与有机相体积比为1B1时得到最大活性的酸性磷酸酶。,二、反胶束中的酶学研究 有机相酶催化反应在生物工程领域的应用,引起人们极大兴趣，其相关研究文献迅速增多。20多年的研究表明，有机介质中酶催化反应与水介质中反应相比具有许多特点和优势。,含微量水的反胶束体系具有以下几个显著特点：可进行水不溶性化合物的催化转化，拓宽了酶的作用底物;酶的热稳定性大大提高；减少了有水引起的副反应；能改变反应的平衡点,使反应朝期望的方向进行；可使极性不同的底物与反应物原位分离，降低分离能耗。,