《分析色谱》PPT课件.ppt

第十八章平面色谱法(plane chromatography),在平面上进行分离的一种色谱方法，主要包括薄层色谱法和纸色谱法。纸色谱法薄层色谱法,第一节平面色谱法的分类和原理,分类薄层色谱法：吸附薄层色谱法分配薄层色谱法分子排阻薄层色谱法 纸色谱法:分配薄层电泳法,平面色谱法参数,定性参数相平衡参数面效参数分离参数,定性参数1,比移值(Rf值)溶质移动距离与流动相移动距离之比。（速度之比？）Rf=L/L0（定时展开）L为原点（origin）至斑点中心的距离，L0为原点至溶剂前沿（solvent front）的距离 与组分及色谱条件有关,定性参数2,相对比移值(relative Rf；Rr)Rr=Rf(i)/Rf(s)=L(i)/L(s)与组分、色谱条件、参考物质有关。Rr值可以大于1，也可以小于1。重现性和可比性均比Rf值好，能消除系统误差（参考物质与组分在完全相同的条件下展开）,相平衡参数,分配系数K=Cs/Cm 容量因子 k=CsVs/CmVmK、k与Rf值的关系：,相平衡参数,K、k与Rf值关系推导：(与定距展开比较)Rf=L/L0=u/u0=R=R为保留比,第二节薄层色谱法(thin layer chromatography；TLC),固定相（吸附剂或载体）涂布成一均匀薄层，点样，（密闭的容器中）展开，斑点显色，（与对照物质）比较进行定性定量。,特点：快，需十至几十分钟，同时展开多个试样。试样预处理简单，对试样限制少。载样量比较大，适用于制备。仪器简单，操作方便。分离能力较强。灵敏度较高。,一、薄层色谱法的主要类型和原理,吸附薄层色谱法原理：组分在薄层板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的过程。吸附系数不等实现分离。一般极性强的组分K大，Rf值小；极性弱的组分 K小，Rf值大。,薄层色谱法的主要类型和原理,分配薄层色谱法原理：多次分配的过程，分配系数（溶解度）不等实现分离分类：正相色谱、反相色谱,薄层色谱法的主要类型和原理,分配薄层色谱法正相色谱：水为固定相（硅胶载体），有机溶剂为流动相。极性强的组分K大，Rf值小。反相色谱：烷基化学键合相为固定相，水有机溶剂为流动相。极性强的组分K小，Rf值大。,二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂,吸附剂硅胶：多孔性微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。原理：硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键（吸附性）。组分与硅醇基形成氢键（被吸附）的能力不同而分离。应用：酸性和中性物质的分离，如有机酸酚类、醛类等,硅胶活度与含水量的关系：含水量高，活性级高，活度低。活化：加热至100左右，除去吸附水提高活度。（注意温度不可过高）分离效率：与其粒度、孔径及表面积等有关。常用硅胶：硅胶H，不含黏合剂硅胶G，含煅石膏硅胶GF254，含煅石膏和一种无机荧光剂，即锰激活的硅酸锌，在254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。,吸附剂氧化铝碱性氧化铝(pH9.0)分离中性或碱性化合物，如生物碱、脂溶性维生素等；中性氧化铝(pH7.5)分离酸性及对碱不稳定的化合物；酸性氧化铝(pH4.0)酸性化合物的分离。活度也与含水量有关。,展开剂(流动相)同吸附柱色谱极性强的溶剂洗脱能力强常用溶剂的极性强弱顺序：水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳环己烷石油醚。,展开剂选择原则：根据被分离物质的极性Stahl简图：极性物质活度低（活性级大）的吸附剂-极性展开剂,展开剂混合溶剂先用单一溶剂展开，若Rf值太小，则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等，如果Rf值太大，则加入适量极性弱的溶剂(如环己烷、石油醚等)，以降低极性。可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。,三、薄层色谱操作方法,制板均匀点样集中展开(多种方式)预饱和显色自学，实验课讲,四、定性和定量分析,定性分析 比较Rf值或Rr值、斑点颜色或荧光常采用已知标准物质对照（同一板上展开）多种展开系统的Rf值与对照品一致。定量分析洗脱法直接定量法1.目视比较法（如杂质限度检查方法）2.薄层扫描法,第三节纸色谱法,一、纸色谱法的分离原理纸纤维为载体，吸着在其上的水为固定相属于正相分配色谱依据分配系数的不同而达到分离极性或亲水性强的组分，K大，Rf值小，极性弱或亲脂性强的组分，K小，Rf值大。极性强弱？例：三个六碳糖,二、纸色谱法的实验条件,色谱纸的选择对Rf值相差很小的化合物，宜采用慢速滤纸对Rf值相差较大的化合物，则可用快速滤纸固定相水或甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇或缓冲溶液。（酸、碱）,纸色谱法的实验条件,展开剂的选择增加展开剂中极性溶剂的比例量，可以增大Rf值；增加展开剂中非极性溶剂的比例量，可以减少Rf值。常用的展开剂水饱和的有机溶剂，如水饱和的正丁醇、正戊醇、酚等操作步骤 点样、展开、显色、定性定量分析,主要内容：,比移值及其与K和k的关系、相对比移值吸附薄层色谱法：原理，吸附剂、展开剂及其选择薄层色谱定性方法纸色谱法：原理和实验条件,第十九章 气相色谱法gas chromatography，GC,分析化学教研室 李发美教授,发展 英国Martin等人于1941年首次提出了用气体作流动相；1952年第一次用气相色谱法分离测定复杂混合物；1955年第一台商品气相色谱仪；近年电子计算机技术。,第一节 气相色谱法的分类和一般流程,一、分类 按固定相的聚集状态:GSC、GLC按分离原理：GSC属于吸附色谱，GLC属于 分配色谱。按色谱操作形式：柱色谱（分填充柱色谱 毛细管柱色谱）,二、特点：高效能：neff可达103106高选择性：特别复杂试样 高灵敏度：可以检测10111013g物质分析速度快、操作简单：色谱操作及数据处理自动化 应用广泛：气体和易挥发或可衍生化为气体弱点：受试样蒸气压限制和定性困难。,三、气相色谱法的一般流程,载气系统（carrier gas system）,色谱柱系统（column system）,检测系统（detection system）,记录系统（data system）,进样系统（sample injection system）,第二节 气相色谱固定相和流动相,一、气液色谱固定相对固定液的要求,在操作温度下蒸气压要低；稳定性好；对被分离组分的选择性要高；对试样中各组分有足够的溶解能力。,固定液的分类,化学分类：依据结构分类烃类：烷烃与芳烃，角鲨烷（异卅烷、C30H62)，标准非极性固定液。硅氧烷类：甲基、苯基、氰基、氟硅氧烷等，最通用聚醇：如聚乙二醇PEG20M，氢键型聚酯：丁二酸二乙二醇聚酯(PDEGS或DEGS),极性分类,用相对极性 P 来表示,q1(lgr1):苯与环己烷在,-氧二丙腈柱上的相对保留值的对数。q2(lgr2):角鲨烷柱上的相对保留值的对数。qx(lgrx):在待测柱上的相对保留值的对数。,相对极性Px分类：,-氧二丙腈：P=100角鲨烷：P=0其余：Px=0-100 分为5级0200或1非和弱极性 角鲨烷、甲基硅橡胶21402中等极性 DNP、OV-1741603中等极性 氰基硅橡胶61804极性 聚乙二醇811005极性,-氧二丙腈,麦氏常数分类法:以物质m在待测固定液和非极性固定液(通常是沙鱼烷)中的保留指数之差值作为该固定液相对极性强弱的度量,保留指数(I)：,用保留时间紧邻待测组分的两个正构烷烃来标定组分的相对保留值，又称Kovats指数,Ix为待测组分的保留指数，z与z+n为正构烷烃对的碳原子数。规定正己烷、正庚烷及正辛烷为600、700及800,例 在Apiezon L柱上，柱温100，用正庚烷及正辛烷为参考物质对，测得t0=30.0，正庚烷的tR=204.0，乙酸正丁酯的tR=340.0及正辛烷的tR=403.4。,说明乙酸正丁酯在Apiezon L柱上的保留行为相当于7.756个碳原子的正构烷烃的保留行为。,Ix=100（,）=775.6,麦氏常数,苯、丁醇、戊酮-2、硝基丙烷、吡啶五种物质在被测固定液与角鲨烷柱上保留指数的差值,分别以x，y，z，u，s 表示.苯:I=I被测I角鲨烷=x 代表不同类型的作用力，这五个I以及它们的平均值，可以作为固定液极性的标度。其值越大，极性越强。,固定液的选择相似性原则,固定液的选择主要差别,组分极性差别较大：选用极性固定液。沸点差别较大：选用非极性固定液。例：苯与环己烷(苯80.1，环己烷80.7)。苯为弱极性，环己烷为非极性，极性差别是主要矛盾。非极性固定液很难分开。中等极性的固定液，如用邻苯二甲酸二壬酯，则苯的保留时间是环己烷的1.5倍。,固定液的选择麦氏常数,根据作用力例 正丁基乙基醚中杂质正丙醇的检查。希望正丙醇先出。醚是质子受体，醇是质子给体，z 值越大，固定液对质子受体（戊酮-2）的作用力越强，y值越小，固定液对质子给体（丁醇）作用力越弱。应选择z 值大于y值，即具有高z/y值的固定液。,载体（担体）,要求：,表面积大，孔径分布均匀；表面吸附性很弱；热稳定性、化学稳定性好；粒度均匀，有一定的机械强度。,硅藻土型载体红色载体 常与非极性固定液配伍白色载体 常与极性固定液配伍,除去载体表面的铁等金属氧化物。用于分析酸性化合物。,将载体与硅烷化试剂反应，除去载体表面的硅醇基。分析形成氢键能力较强的化合物。,酸洗法,碱洗法,硅烷化法,除去载体表面的Al2O3等酸性作用点。用于分析胺类等碱性化合物。,载体的钝化,二、气固色谱固定相,吸附剂、分子筛、高分子多孔微球及化学键合相等高分子多孔微球（GDX）-具有吸附、分配及分子筛三种作用 耐高温，最高使用温度为200300；峰形好，一般不拖尾；无柱流失现象，柱寿命长；一般按分子量顺序分离的特点,三、流动相（载气）,氢气 氮气,分子量小，热导系数大，粘度小。常用于热导检测器。,要求：纯度在99.99%以上、净化选择：主要取决于检测器、色谱柱及分析要求。,扩散系数小，柱效比较高。除热导检测器以外的其它几种检测器中，多采用氮气作载气。,第三节 检测器,将流动相中组分的浓度或量信号转变成电信号。,浓度型检测器：测量载气中组分浓度的变化热导检测器、电子捕获检测器等。,质量型检测器：测量组分进入检测器的质量流速变化。火焰离子化检测器、火焰光度检测器等。,或,一、检测器的性能指标,灵敏度（sensitivity）浓度型检测器Sc：为1ml载气携带1mg的某组分通过检测器时，产生的电压，Vml/mg；质量型检测器Sm：每秒有1g的某组分被载气携带通过检测器，产生的电压或电流值，mVs/g或As/g。,噪音（noise；N）和漂移（drift；d）,检测器的性能指标,检测限（detectability；D）某组分的峰高恰为噪音的两倍（2N）时，单位时间内载气引入检测器中该组分的质量（g/s），或单位体积载气中所含该组分的量（mg/ml）。D=2N/S 检测限越小，检测器的性能越好。,常用检测器热导检测器（thermal conductivity detector；TCD）氢焰离子化检测器（hydrogen flame ionization detector；FID）电子捕获检测器（electron capture detector；ECD）火焰光度检测器(flame photometric detector；FPD)热离子化检测器(thermionic ionization detector；TID),二、热导检测器（thermal conductivity detector；TCD）,测定原理：利用组分与载气的热导率之差构造：,热导检测器,有组分进入测量臂,若,则,IG取决,热导检测器,热导率：(x102)H2 22.36He 17.42N2 3.14甲烷 4.56乙醇 2.22,热导检测器,注意常用氢气作载气，不能载气勿加桥电流；尽量采用低电流；浓度型检测器，峰面积定量时，需保持流速恒定。,热导检测器,优点:结构简单、适用范围广（无机物，有机物），不破坏样品。缺点:灵敏度低，噪音大。,三、氢焰离子化检测器（hydrogen flame ionization detector；FID）,测定原理测定有机物在氢火焰的作用下，化学电离形成的离子流的强度。,氢焰离子化检测器,在高温火焰作用下，有机物组分电离成正负离子，在收集极（正极）和极化极（负极）外电场作用下定向运动而形成离子流（电流）。放大后被检测。离子流强度决定于：电离的程度-被测组分的性质，进入离子室的被测组分的量,氢焰离子化检测器,注意气体及流量：燃气用氢气，空气作为助燃气，载气用氮气。流量关系一般为，N2:H2:Air为1:11.5:10。质量型检测器：用峰高定量时，需保持载气流速恒定。,氢焰离子化检测器,优点：灵敏度高，噪音小，死体积小等缺点：破坏样品，一般只能测定含碳化 合物。,四、电子捕获检测器,结构测定原理N2+e AB+e AB+E,第四节 分离条件的选择,一、气相色谱速率理论H=A+B/u+Cu,气相色谱速率理论,涡流扩散项（eddy diffusion）A A=2dp 粒度较细，颗粒均匀，一般为6080目或80100目的填料。填充均匀。空心毛细管柱无多径项，A=0。,气相色谱速率理论,分子扩散项（molecular diffusion）B/u B=2Dg 1、填充柱1，硅藻土 为0.50.7空心毛细管柱1,气相色谱速率理论,2、Dg与组分的性质有关。与载气的分子量（M）的平方根成反比，随柱温（T）升高而增大，随柱压（P）增大而减小。因此采用 载气线速度较低时用氮气，较高时宜用氦气或氢气。较低的柱温。3、u 用较高的载气流速。,气相色谱速率理论,传质阻抗项（mass transfer resistance）Cu=(Cg+Cl)u填充柱：Cg很小，忽略不计，故CCl,气相色谱速率理论,df，固定相的液膜厚度要薄D1，组分在液相中的扩散系数要大U：,气相色谱中影响柱效的因素：柱填充的均匀程度载体的粒度，表面无深孔固定液的液膜厚度（气液）载气的流速和种类柱温,气相色谱速率理论,二、实验条件的选择,分离方程式：,a为柱效项：柱性能b为柱选择性项：=K2/K1=k2/k1，固定液c为柱容量因子项：柱温、固定液量、K,a b c,实验条件的选择,n、k 对分离度的影响,如何获得满意的分离度？,（一）提高和适当k,固定液的选择：分配系数比（选择性）及容量因子：固定液种类。原则？极性、最高使用温度。容量因子k：固定液的用量、分配系数、柱温，k要适当。,（二）提高n,载气流速和种类 的选择,流速0u最佳：选用分子量较大的载气，如N2、Aruu最佳：选用分子量较小的气体，如H2、He,线速度：稍高于最佳流速。,提高n,柱温的选择：TC：K，不利 Dg，不利 Dl，Cl 有利,提高n,柱温的选择：选择原则：不超过固定液最高使用温度；在良好分离，分析时间适宜，不拖尾的前提下，尽可能采用低柱温。高沸点混合物：低于沸点100150，低固定液配比（1%3%）沸点300的试样：比平均沸点低50至平均沸点,宽沸程试样：程序升温，改善分离效果，缩短分析时间，提高灵敏度。,提高n,柱长和内径的选择：在达到一定分离度的条件下，应使用尽可能短的柱。,其他条件的选择：气化室温度：等于或稍高于试样的沸点，不超过沸点50以上，高于柱温3050。检测室温度：高于至少等于柱温。进样时间和进样量：进样速度快，在1s以内。试样不超载。,第六节定性与定量分析,一、定性分析方法 已知物对照法保留值、加样、双柱定性利用相对保留值定性利用保留指数定性 官能团分类测定法 两谱联用定性,二、定量分析方法,定量分析的依据：在恒定的实验条件下，峰面积（或峰高）与组分的（含）量成正比。但，同一检测器对不同物质具有不同的响应灵敏度。,二、定量分析方法,（一）定量校正因子 绝对（重量）校正因子单位峰面积（或峰高）所代表的物质的质量。其值随实验条件而变化。,相对（重量）校正因子：fi物质i和标准物质s的绝对校正因子之比。标准物质:苯、正庚烷测定法：准确称取物质i和标准物质s，混匀，进样，测得峰面积。注意：实验条件的一致。,（二）定量方法,归一化法 样品所有组分都产生色谱峰校正因子相等时，直接用峰面积。,归一化法 优点：简便、定量结果与进样量无关、受操作条件变化影响较小。缺点：必须所有组分在一个分析周期内都能流出色谱柱，检测器对它们都产生信号。不适用于微量杂质的测定。例：甲醇、乙醇、正丙醇,（二）定量方法,外标法：校正曲线：用对照品配成不同浓度的对照液，定量进样，用峰面积对对照品的量（或浓度）作线性回归，求出斜率、截距，而后计算样品的含量。,外标法：校正曲线截距近似零时，外标一点法：用一种浓度对照溶液 优点：简便，不用校正因子，不必加内标物只需待测组分出峰。缺点：结果的准确度与进样量的重复性和操作条件的稳定性有关。,（二）定量方法,内标法：以一定量的纯物质（内标物），加入到准确称定的试样中，根据试样和内标物的重量及其峰面积比，求出某组分的含量。,内标法：优点：只需内标物及欲测组分出峰，操作条件变化而引起的误差小。缺点：内标物选择难内标物的选择：应是试样中不存在的纯物质；色谱峰位于被测组分色谱峰附近，或几个被测组分色谱峰中间，并完全分离。,（二）定量方法,内标校正曲线法：一系列不同浓度的对照液，并加入相同量的内标物，测Ai和As，以Ai/As对对照溶液浓度作图。求出斜率、截距后。试样液也加入与对照液相同量的内标物，测得Ai/As。计算试样的含量。,（二）定量方法,内标对比法（内标一点法）：,主要内容,固定液的分类和选择检测器的性能指标热导、氢焰检测器的原理和注意事项速率理论和实验条件的选择定量分析方法,第二十章高效液相色谱法high performance liquid chromatography；HPLC,分析化学教研室李发美教授,经典液相色谱法为基础，引入气相色谱法的理论和实验技术，高压输送流动相，高效固定相及高灵敏度检测器，现代液相色谱分析方法。,与经典液相色谱法相比,颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测限可达1012g。,与气相色谱法相比,不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，选择性高；一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。,第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理,一、主要类型四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography）吸附色谱法（adsorption chromatography）离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（SEC）,第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理,一、主要类型四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography）吸附色谱法（adsorption chromatography）离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（SEC）化学键合相色谱法,其他色谱类型亲合色谱法（affinity chromatography；AC）手性色谱法（chiral chromatography；CC）胶束色谱法（micellar chromatography；MC）电色谱法（electrochromatography；EC）,二、化学键合相色谱法,以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法(bonded phase chromatography；BPC)化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相,优点：固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易流失，使用周期长；柱效高；重现性好；能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高正相（normal phase，NP）和反相（reversed phase，RP）键合相色谱法：根据化学键合相与流动相极性的相对强弱,（一）正相键合相色谱法,固定相：极性键合相如氰基（CN）、氨基（NH2）或二羟基键合硅胶。（经典：水饱和的硅胶）流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂）适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物如一些在硅胶柱上分离的物质,正相键合相色谱法,分离机制？分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用分离选择性：极性强的组分k大，后洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR 减小。,（二）反相键合相色谱法,固定相：非极性键合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶 流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂常用甲醇水、乙腈水等应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等）,保留机制疏溶剂理论（solvophobic theory）,溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。不是溶质分子与键合相间的色散力，,反相键合相色谱法,保留行为的主要影响因素1、溶质的分子结构（极性）极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。同系物碳数越多，极性越弱，k越大；引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。2、固定相键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。,反相键合相色谱法,保留行为的主要影响因素3、流动相极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂溶剂比例：水的比例增加，使k增大中性盐的加入：使中性溶质的k增大pH：影响弱酸、弱减的离解流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小。,离子抑制色谱法（ion suppression chromatography；ISC）用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，使k变大。适用于3pKa7的弱酸、7pKa8的弱碱,反相键合相色谱法,把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子（counter ion）生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使k增加，改善分离效果。,（三）反相离子对色谱法 paired ionchromatography；PIC ion pair chromatography；IPC,反相离子对色谱法,离子对模型,3,3,+,+,(,),+,3,s,3,(,+,固定相,+,(,),+,B,),+,流动相,通式,影响容量因子的因素,离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的k增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大 流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大固定相、流动相性质（同一般RP-HPLC）。,适用范围：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化合物的混合物。分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁基铵磷酸盐（TBA）和溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）等分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸盐或硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠（PICB5）、正己烷基磺酸钠（PICB6）、,适用范围和离子对试剂的选择,第二节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,固定相应符合下列要求：颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压；化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。,一、化学键合相色谱法的固定相,（一）键合相的种类 非极性键合相：非极性烃基，如C18C8C1与苯基等键合在硅胶表面；用于反相色谱；长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高，稳定性更好。,键合相的种类,弱极性键合相：醚基和二羟基等键合相用于反相或正相色谱极性键合相：常用氨基氰基键合相（氰乙硅烷基Si(CH2)2CN)键合硅胶一般用于正相色谱 特殊用途的键合相,（二）键合相的性质和特点,键合反应硅氧烷（SiOSiC）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应,如：YWGC18H37，无定形硅胶YWG上键合了十八硅烷基；Spherisorb ODS，球形硅胶Spherisorb 上键合了ODS。,键合相的性质和特点,键合相的性质含碳量：含碳的百分数 覆盖度：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例 封尾（end-capping）：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。,键合相的特点使用过程中不流失；化学稳定性好；适于梯度洗脱；载样量大 注意：流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解；(也有适用宽pH范围的键合相)。,键合相的性质和特点,二、化学键合相色谱法的流动相,对流动相的要求：与固定相不发生化学反应。对试样有适宜的溶解度。使k在110范围内，与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇乙腈等可以降低柱压，提高柱效。,（一）流动相对分离的影响n由色谱柱（固定相）性能决定，主要受溶剂种类的影响，k受溶剂配比的影响。,（二）流动相的强度和选择性溶剂的极性（强度）正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 溶剂的选择性不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同 混合溶剂（二元或多元流动相）,三、分离条件的选择,（一）HPLC中的速率理论涡流扩散A=2dp 球形、小粒度、均匀（RSD5%）固定相，匀浆高压填充，以降低A。纵向扩散=2Dm 可以忽略。因为Dl很小，室温操作，且U大于U最佳，,HPLC中的速率理论,传质阻抗固定相传质阻抗CS可以忽略，因df极小流动相传质阻抗Cm 要求：dp小，Dm大,静态流动相传质阻抗：由于部分流动相在固定相微孔内的滞留静态流动相传质阻抗系数Csm Csm dp2，Csm 1/Dm，而DmT/要求:固定相dp2、流动相都小,HPLC中的速率理论,H=A+Cmu+Csmu 原因：化学键合相，液体流动相结果：HPLC的实验条件应该是：小粒度、均匀的球形化学键合相；低粘度流动相，流速不宜过快；柱温适当。,HPLC中的速率理论,（二）正相键合相色谱法的分离条件,固定相极性键合相如氰基、氨基键合相等 流动相烷烃加适量极性调节剂,（三）反相键合相色谱法的分离条件,固定相非极性键合相如ODS流动相以水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等极性调节剂弱酸、弱碱或缓冲盐作为离子抑制剂加入0.1%1%的醋酸盐、磷酸盐可减少残余硅醇基的作用,（四）反相离子对色谱法的分离条件,固定相 尽可能选择表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相，离子对试剂 离子对试剂所带的电荷应与试样离子的电荷相反 流动相pH使试样组分与离子对试剂全部离子化有机溶剂及其浓度 同一般HPLC,第三节高效液相色谱仪,组成输液系统进样系统色谱柱系统检测系统数据记录处理系统,一、输液系统,高压输液泵恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵双泵：为了克服流量的脉动。有串联式和并联式,输液系统,输液泵应具备的性能：流量精度高且稳定流量范围宽能在高压下连续工作液缸容积小密封性能好，耐腐蚀,输液系统,输液泵操作注意事项：防止固体微粒进入泵体流动相不应含有腐蚀性物质防止溶剂瓶内的流动相被用完不超过规定的最高压力流动相一般应该先脱气,二、分离和进样系统,进样器进样阀（六通阀）、自动进样装置色谱柱（column）由柱管和固定相组成分析柱、制备柱 性能评价 H、n、fs、k和的重复性，或R。,三、检测系统,（一）检测器(detector)的主要性能要求：灵敏度（sensitivity）高（检测限低）噪音（noise）低线性范围（linear range）宽重复性（repeatability）好适用范围广（通用型、专属型）,（二）紫外检测器(ultraviolet detector),检测原理：朗伯比尔(Lambert-Beer)定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=Cl特点：灵敏度较高（10-610-9 g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）。局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。专属型、浓度型检测器,紫外检测器,固定波长检测器：254nm可变波长检测器：光源：氘灯（和钨灯），200400（800）nm，单色器，流通池（试样），光电管光路系统和紫外分光光度计相似 光电二极管阵列检测器(photodiode array detector；PDAD)：一系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上约1nm谱带宽的单色光,紫外检测器,光电二极管阵列检测器工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，分光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三维光谱色谱图。用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量,判断峰纯度。,紫外检测器,（三）荧光检测器(fluorescence detector；FD),检测原理：化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的光，称为荧光；荧光强度(F)与激发光强度(I0)及荧光物质浓度(C)之间的关系为：F=2.3QKI0Cl Q为量子产率，K为荧光效率，为摩尔吸光系数，l为光径长度。F=KC,荧光检测器(fluorescence detector；FD),特点：选择性好，专属型检测器灵敏度比紫外检测器高（检测限10-10 g/ml）激发波长(ex)和发射波长(em)的选择,第四节 高效液相色谱分析方法,定性分析方法定量分析方法：外标法、内标法同GC（自己看）,主要内容,化学键合相色谱法的原理：反相键合相色谱法反相离子对色谱法正相键合相色谱法化学键合相色谱法的固定相、流动相化学键合相色谱法的分离条件高效液相色谱中的速率理论定量分析方法紫外、荧光检测器,