《分子生物学研究法》PPT课件.ppt

分子生物学研究法,一.重组DNA技术概论二.常见的DNA操作技术三.基因克隆技术(狭义)四.基因表达研究技术五.基因芯片及数据分析六.蛋白质组学及其研究技术,一.重组DNA技术概论,二.常见的DNA操作技术,2.1 琼脂糖凝胶电泳2.2 SDS-PAGE 电泳2.3 PCR技术2.4 测序技术2.5 杂交技术2.6 ELISA 技术2.7 细菌转化2.8 cDNA文库2.9 SNP技术及应用2.10 基因打靶,琼脂糖凝胶电泳,1、原理：2、用途：3、技术要点,琼脂糖凝胶电泳的原理,1.DNA电泳迁移：电荷效应分子筛效益（1）DNA带负电，电场中，向正极移动；（2）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷数，构型；(3)线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成反比；（分子量越大，跑得越慢）2、检测原理：（1）溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中，在紫外光照射下，发射荧光。,琼脂糖凝胶电泳用途,1.DNA分子量测定（距离分子量）2.基因，克隆的鉴定（通过1完成）3、不同长度的基因片断的分离4、DNA浓度的测定（荧光的强度与DNA含量成正比）*也可用于蛋白的分离鉴定,加标准分子量DNA Marker,测定分子量加标准浓度的DNA，测定浓度,琼脂糖凝胶电泳技术要点,1.不同浓度凝胶分辨DNA片段能力不一样(p33)(1)低:不利于小片段的分辨(扩散)(2)高:不利于大片段的分辨(迁移不动)(3)一般选1.0%2.凝胶要用缓冲液配(TBE 或 TAE)3.EB强致癌，带手套操作；4.agarose(琼脂糖）电泳 agar(含琼脂糖和琼脂胶）平板培养基,SDS-PAGE 电泳,1、原理2、用途3、技术要点,SDS-PAGE 电泳原理,1.SDS(带负电)和还原剂破坏蛋白的高级结构,同时SDS与蛋白定量结合,消除蛋白之间的电荷差异,使得蛋白的迁移率主要依赖分子量(分子小跑得快).2.不连续电泳:上层为浓缩胶,可将样品压缩到同一起跑线,下层为分离胶;可获得更高的分辨率.3.考马斯亮蓝进行染色.,SDS-PAGE 电泳用途,1.蛋白分子量的测定2.蛋白浓度的测定3.蛋白的鉴定(通过1来实现),SDS-PAGE 技术要点,1.浓缩胶一般用5%,分离胶:次高分子(10万-20 万)用7%,低分子(1.4万10万）用122、PAGE配制时带手套，（Acr-Bis液体有积累性神经毒，聚合后无毒)3.SDSPAGE测定的是单体蛋白分子量；（多亚基不行）4、SDSPAGE不适于：（1）电荷异常蛋白：组蛋白（电多）（2）构象异常的 蛋白（3）带有较大辅基的蛋白糖蛋白，脂蛋白。,PCR技术,1、原理2、应用3、技术要点,PCR技术原理,循环过程(32 次左右）1.解链：94,30 s2.引物结合:？，30 s3.延伸：72，？Min 特点1.引物两条，以2n指数扩增（前20-25次），后面扩增效率降低，30次以后，基本进入平台期。2.引物结合温度？一般为50-55，需要调整；3.延伸时间？Min需要调整，一般1kb/min.,PCR技术应用,1.基因检测；2.基因的制备（包括基因的修饰）,PCR技术操作要点,1.灵敏度高，防止污染，出现假阳性(带手套，设立阴性，阳性对照）；2.需要摸索结合温度，提高扩增的特异性。,杂交技术,1.Southern blot-检测DNA2.Northern blot-检测RNA3.Western blot-检测蛋白,Southern blot,Northern blot和Western blot 比较,ELISA 原理和用途类似于Western blot,但在酶标板中操作，无需SDS-PAGE转膜，操作简单，可批量检测，并可半定量测定。,Southern blot,Northern blot,Western blot,双脱氧法测序(Dudeoxy sequence analyses),双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序1.原理：Atkinson发现用 DNA pol 合成DNA时如在反 应物中加入一定量的 2,3ddTTP 时，因ddT 的3碳原子不含OH,故DNA不能延伸。1982年Sanger 利用此原理建立了双脱氧测序法。原理和加减法相似，但不再是加一种dNTP或减一种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷，来终止聚合反应。用此法测得G4含5577bp.,2.1 细菌转化,通常情况下，外源基因无法进入细菌细胞内；当用电击法，或CaCl2，或RuCl等方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源基因进入的感受态细胞。感受态细胞的活性较低，处理需温柔。,2.2 PCR(聚合酶链式反应)技术,PCR的基本原理变性、复性、半保留复制 PCR三步曲变性 9097退火 4555延伸 72,PCR,2.3 cDNA文库,cDNA:(1)将mRNA反转录为双链DNA.(2)特点:A.稳定;B.无内含子.二.cDNA文库:(1)代表了生物体某一器官或者组织mRNA中所含的全部或绝大部分遗传信息.(2)特点:A.不同的生物,同一生物不同组织,同一组织不同发育时间或不同生理状态下,cDNA文库不同;B.建好的cDNA文库的具体的信息未知,仅提供吊取相关目的基因的材料.C.每个克隆不一定是全长基因,cDNA文库建库过程,1.高质量mRNA的制备;2.反转录生成cDNA3.与载体分子连接(噬菌体文库)4.转染(噬菌体的包装),说明:引物 oligo dT,随机引物R6(得到全长cDNA)两端可加上酶切接头,便于克隆到载体上.合成时,原料用甲基化的dCTP.防止酶切时损伤内部序列.转化效率要高,防止少量表达的mRNA未得到克隆.,2.4 SNP技术及应用,Single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性(标记)是指同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性。用途:(1)遗传的分子标记-物种鉴定(2)生物功能异常的基因标记-疾病的检测;,Single nucleotide polymorphism,SNP的特征,SNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种，占所有已知多态性的90%以上，在人类基因组中广泛存在，大约平均1000个碱基对就会出现一个SNP，估计整个人类基因组30亿碱基中至少有300万个SNP。SNP大都表现为二等位基因（bialletic)多态性,即在该位置只存在两种不同的碱基。SNP作为一种碱基的替换，大多数为转换（CT，GA），也可能是颠换。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，而且在CG序列上出现最为频繁，多是发生CT的转换，原因是CG中的C是甲基化的，它能自发的脱氨基而替换为胸腺嘧啶。,SNP的检测方法,单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism,SSCP)原理：单链DNA的折叠结构是由单核苷酸序列决定的，当某一个碱基发生突变时，便会直接影响该链的构象，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移率会发生改变。,变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)原理:当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。,荧光共振能量传递(fluorescent resonance energy transfer,FRET),供者,受者,探针,5,3,Taqman法,分子信标(molecular beacon)法,高效液相色谱-质谱分析法DNA芯片技术（DNA chip）,SNP数据库,美国国立生物技术信息中心 http:/德国的HGBAS网站 http:/日本JST的数据库,2.5基因打靶(gene targeting),通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究该基因的功能。(反向遗传学)基因敲除(gene knockout)：定向敲除基因敲入(gene knockin)：定向替代,基因打靶的必备条件,胚胎干细胞(ES细胞)能在体外培养，保留发育的全能性打靶载体Neo（新霉素）阳性筛选标志HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase),基因敲除的基本程序,打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞：重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种,基因敲除 Knockout,1.完全基因敲除-可能会致死.2.条件型基因敲除 Cre/LoxP,FLP/FRT,基因敲除的缺点,能将基因与表型(生物功能)联系起来,但不能提供具体的作用机制;对多基因决定的表型无法将其联系全部找出;操作复杂,成本高.,三.基因克隆技术(狭义)获取目的基因的技术,1.RACE 技术2.cDNA差示显示法3.基因大规模克隆技术4.酵母双杂交法5.酵母单杂交系统6.基因的图位克隆法,3.1 RACE 技术,Rapid amplification of cDNA ends已知基因一端序列,快速获取另一端序列.5 RACE(获取5序列)3 RACE(获取3序列)需要合成引物接头(单链DNA),用RNA ligase将基因(RNA)与引物(DNA)连接.,5 RACE,3 RACE(非mRNA扩增),合成两条互补的引物,序列任意.及一条序列特异的引物互补引物中一条5标记 Pi,通过RNA ligase 将其与RNA连接.,3.2 cDNA差示显示法(cDNA-RDA),仅知道生理功能,性状,对基因序列一无所知.获得该相关基因的方法.原理:A.样本(sample)与对照(control)mRNAs被转录成cDNA,酶切加可PCR扩增接头,扩增后除去接头,只有样本被加上新接头(可PCR扩增).B.样本(ss)与过量对照(cc)杂交后,PCR扩增.sc被线形扩增;ss被指数扩增;CC不被扩增.,3.3 基因大规模克隆技术(Gateway 克隆技术),1.不需要酶切,连接;2.利用TOPO反应,将PCR产物克隆到Entry载体;再通过LR反应,将基因定点,定向重组到表达载体.3.上游引物5端需要引入CACC序列.,3.4 酵母双杂交法（蛋白蛋白相互作用）,1.筛选与已知蛋白相互作用的蛋白基因2.真核生物的转录激活子基本结构 一般有2个功能域（functional domain）DNA结合域（DNA-binding domain）DBD转录激活域（transcription-activating domain）-AD(许多激活子还有二聚体化域,有的还有受体结合域),“猎物”为一个库；将不同的“诱饵”克隆后，捕获不同的“猎物”,.5 酵母单杂交（蛋白核酸相互作用）,用于鉴定与特定顺式作用元件（DNA序列）作用的转录调控因子的DNA结合域或反之,.6 基因的图位克隆法,目的：克隆具有某种表型的未知基因的方法原理：略,四.基因表达研究技术,.基因表达系列分析技术（SAGE)2.RNA选择性剪切机制3.原位杂交技术.定点突变技术RNAi技术,4.基因表达系列分析技术（SAGE),以测序为基础的定量分析全基因组表达模式的技术，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息；理论依据：碱基的核酸片段可代表一种转录产物的特异序列（序列标签）某序列标签占总标签数的比例对应编码基因的表达频率,4.2.RNA选择性剪切机制,RT-PCR扩增不同组织特异基因电泳分析片段大小是否一致,.3.原位杂交技术,通过标记的核酸探针,在组织,细胞,间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段.(1)RNA原位杂交-组织切片中,该基因的表达产物(mRNA)在细胞水平上作出定性定量分析.-区别 免疫组化(蛋白)(2)染色体原位杂交-eg.荧光原位杂交(FISH),确定DNA序列染色体上的位置.,4.3 定点突变,1.研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构,功能的影响;2.改造DNA调控序列,修饰表达载体,引入新的酶切位点.,TaKaRa mutation kit,4.4 RNAi技术,RNAi是指dsRNA诱导产生的细胞内同源基因表达阻断的生物学现象。在线虫、昆虫、哺乳动物、植物和真菌中广泛存在。是转录后基因沉默（PTGS）的重要机制。细胞利用RNAi抵御病毒和其它外源核酸的侵染，阻断转座子的作用。,双链RNA先被切割酶Dicer切割成2123 个碱基对的siRNA中间体，触发形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）。在ATP的存在下，复合物中双链RNA被螺旋酶解旋，形成单链RNA（ssRNA）的活化体。一旦单链RNA同目的mRNA配对，核酸酶被活化，在复合物内部降解 mRNA。,RNAi的应用,基因功能的研究：RNAi作为一种反相遗传工具，可通过抑制特定基因的表达来研究该基因功能。基因治疗：可用于抑制参与病程的开始或发展的蛋白质的产生，例如参与病毒或寄生虫与宿主相互作用、病原体的复制、癌症的发生及细胞毒性的蛋白质。,RNAi的缺点,A.在哺乳动物中，存在非特异性效应的dsRNA触发途径,如（1）dsRNA依赖的蛋白激酶(PKR)和干扰素途径，该途径引起对蛋白合成和凋亡的全身性的抑制；(2)dsRNA诱导的25多聚腺苷酸的合成，该途径导致非特异性的RNA酶即RnaseL的活化。但PKR不能被少于30个核苷的dsRNA活化，可以通过实验设计尽量避免。但非特异性RNAi效应有时还是存在，而且不可预测。对有的高表达的基因，RNAi可能会无效或效果不明显。质粒转染的RNAi效果比较短暂（约1周左右）。对一个基因设计的不同片段的RNAi可能效果差异很大，筛选的工作量繁重。有时细胞导入效率低下，也增加了技术实现的难度。,4.5 生物芯片技术,生物芯片是八十年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固格体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。,主要特点,高通量、微型化和自动化。芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列，能够在短时间内分析大量的生物分子，使人们快速准确地获取样品中的生物信息，效率是传统检测手段的成百上千倍。但目前的成本较高，重复性较差。,生物芯片分类(1)-用途,1.样品制备芯片2.生化反应芯片（如PCR芯片）3.检测芯片（如基因芯片，蛋白芯片）4.芯片实验室（是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品的制备、生化反应到检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统）。,生物芯片分类(2)-制造技术,六.蛋白质组学及其研究技术,1.双向电泳2.质谱技术3.蛋白质免疫印迹实验4.EMSA5.噬菌体展示技术6.免疫共沉淀技术7.蛋白质磷酸化分析,6.1 双向电泳,双向电泳是蛋白质组学中对蛋白质组进行研究的主要分离方法，同时能分离成百上千种蛋白质。蛋白质在第一向根据电荷的不同（等电聚焦），第二向根据分子量的不同进行分离（SDS-PAGE）。分离后对蛋白质进行染色，根据实际分析情况，分别进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色。扫描后用相关软件（PDQUEST等）进行图谱分析，分析差别点等。双向电泳与质谱技术联用，还可以进一步分析差别点蛋白的特性。,6.2 MS质谱技术,质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比(m/z)的差异来分析蛋白质和多肽的分子量和对蛋白质进行鉴定，磷酸化蛋白质分析、糖基化蛋白质分析、ICAT差异定量、多肽DE NOVO序列分析、复杂蛋白质混合物酶解和shotgun鉴定，也能检测核酸的SNP,蛋白和核酸的非共价相互作用。,MALDI-TOF 和 ESI-MS,MALDI基质辅助激光解吸离子化是将样品均匀包埋在固体基质中，基质吸收激光提供的能量而蒸发，携带部分样品分子进入气相，并将一部分能量传递给样品分子使其离子化，这种质谱仪的特点是可分析分子量较大的分子，对杂质的忍耐性较好。ESI-电喷雾质谱仪，通过样品溶液在毛细管喷雾口形成液滴，在强电场和热的干燥气的共同作用下，液滴逐渐被气化，同时也被质子化；喷雾口与离子聚焦传输区之间的压力差推动质子化样品进入质量分析器进行检测。,MALDI-TOF MS 分析21-aa 肽(理论分子量 2404),6.3 Western blotting,6.4 EMSA,凝胶阻滞试验(electrophoretic mobility shift assay)体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术.原理:非变性电泳中,核酸蛋白结合后,泳动速度变慢.,6.5 噬菌体展示技术,蛋白-蛋白相互作用将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，从而使多肽能够展示在病毒颗粒的表面，展示在噬菌体表面的多肽配体与各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)通过一种被称为淘选的体外选择程序得以快速筛选鉴定。噬菌体展示技术构建的文库容量大，可进行多次“淘选”富集，十分适用于高通量筛选，因此可以广泛应用于蛋白质相互作用分析等方面的研究，也是进行多肽药物筛选的重要手段。,6.6 免疫共沉淀技术(CoIP),蛋白-蛋白相互作用常验证酵母双杂交的结果,6.7蛋白质磷酸化分析,蛋白磷酸化是一种重要的细胞信号调控方式一般在丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸上磷酸化.蛋白激酶-磷酸化;蛋白质磷酸酯酶-去磷酸化.一般通过双向电泳和质谱分析.,