《分子生物学实验》PPT课件.ppt

分子生物学实验安排,实验项目,E.coli重组表达GFP；利用杆状病毒在昆虫细胞中表达GFP；组装慢病毒表达目的蛋白。,三周（周六、周日）,总RNA的抽提：从病毒感染的sf9中抽提总RNART-PCR：以总RNA为模板克隆eGFP基因原核表达载体的构建：构建pET28a-GFP感受态细胞的制备：制备BL21（DE3）感受态细胞原核诱导表达GFP：构建克隆GFP的重组杆状病毒：在sf9细胞中表达GFP。构建克隆RFP的慢病毒：GFP的表达与鉴定,第2周,第3周,第4周,时间节点：3月11日,时间节点：3月12日,时间节点：3月18日,时间节点：3月19日,时间节点：3月25日,重组Bacmid的抽提与鉴定,时间节点：3月26日,Bacmid转染sf9细胞，制备重组病毒慢病毒载体转染293T细胞制备慢病毒3日后，即3月29日通过荧光显微镜观察细胞状态及发荧光情况。,试剂安排,69人上课按照4人一组进行分组，共17组教室：512；517.每组一套试剂和工具,一、总RNA的抽提（一人一份,3.26）,目的：学习总RNA的抽提以及RNA的操作。试剂：细胞：每组一瓶Trizol：RNAiso氯仿：异丙醇DEPC水70%的乙醇：DEPC水配制DNase/RNase-Free Tips and Tubes逆转录酶：引物DEPC水dNTPmix,操作注意事项：,全程戴一次性手套操作；涉及RNA的操作时尽量不要开口说话；涉及RNA的操作时尽量不要在四周走动；取用试剂后及时封盖。,操作步骤,细胞匀浆：感染病毒4天的sf9细胞 剧烈摇晃细胞瓶使细胞脱落下来；每人取1ml细胞培养物于RNase和DNase Free的EP管中；1000rpm，4C离心5min；弃去上清，并倒置于吸水纸上1分钟；加入1 ml的RNAiso Plus，反复振荡数次使细胞完全裂解；可用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。室温静置5分钟。,Total RNA的提取向匀浆裂解液中加入200L氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖；用手剧烈振荡15秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）；待溶液充分乳化（无分层现象）后，再室温静置5分钟。12,000 g，4离心15分钟。从离心机中小心取出离心管（勿晃动），此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置10分钟。12,000 g，4离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。,RNA沉淀的清洗小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入DEPC配制的75乙醇1ml（切勿触及沉淀）；轻轻上下颠倒数次，12,000 g，4离心5分钟后小心弃去上清；,RNA的溶解室温自然晾干沉淀25分钟加入20l的RNase-free水溶解沉淀必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后-80保存，或暂时于冰上保存。取10 l总RNA与10 x Loading Buffer混合与1%agarose gel凝胶电泳。100V，电泳20min，拍照记录。剩余的RNA样品用于RT-PCR,二、RT-PCR克隆目的基因,逆转录合成第一链cDNA；PCR扩增目的基因；PCR产物的纯化；制备目的DNA克隆片段,2.1 逆转录合成第一链cDNA（一组一份）,建议：大家使用3L总RNA样品,2.2 PCR扩增目的基因（一人一份）,1、PCR反应体系,充分混匀后用marker笔标记好，然后放入PCR仪中，按下列条件进行反应：94 C,5min94 C,0.5min55 C,30 sec72 C,1min72 C,10min4 C,取5 l PCR产物1%agarose gel电泳分析PCR：有或无？大小？,30次循环,2.3 pET28a质粒的制备(一组一份),目的：学习质粒DNA的抽提方法操作步骤,实验步骤,硅膜法抽提质粒DNA,取3 ml TG1挑斑培养过夜的菌液，12,000g,离心1 min，弃尽上清。加250 l S1 重悬细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。加250 l S2，温和并充分地上下颠倒数次混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5 min。加350 l S3，温和并充分地上下颠倒数次，12,000g 离心5 min。吸取步骤4 中离心产生的上清并转移到制备管中（之前置于2 ml 离心管），12,000g离心1 min，弃滤液。将制备管置回离心管，加500 l W1，12,000g 离心1 min，弃滤液。将制备管置回离心管，加700 l W2，12,000g 离心1 min，弃滤液；以同样的方法再用700 l W2 洗涤一次。弃滤液。将制备管置回2 ml 离心管中，12,000g 离心1 min。,取出制备管移入新的1.5 ml 离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加30 l 预热的去离子水，室温静置1 min。12,000g 离心1 min。洗脱下来的溶液即质粒DNA样品。取5 l DNA样品1%Agarose凝胶电泳检测。,2.4 PCR产物的纯化（一组一份）,此实验方法针对DNA样品中75bp以上的DNA进行纯化，去除小分子DNA、寡核苷酸链、单核苷酸、盐离子、蛋白质等。可用于：PCR产物的纯化DNA酶切产物的纯化其原理：硅柱法分离DNA,硅柱吸附法,合并PCR产物至150 l。注：若PCR产物不足150 l，用水补足。在PCR产物中，加入450 l的 PCR-A。混合均匀后转移到制备管中，将制备管置于2 ml 离心管，12,000g 离心1 min，弃滤液。将制备管置回2 ml 离心管，加700 l W2，10,000rpm 离心1 min，弃滤液。将制备管置回 2 ml 离心管，加 400 l W2，10,000rpm离心1 min；将制备管置于洁净的1.5 ml 离心管中，在制备管膜中央加 60 l ddH2O(65预热)，室温静置1 min。10,000rpm 离心1 min 洗脱DNA。即离心下来的溶液即为纯化的PCR样品。每组取5 l样品1%Agarose凝胶电泳。,三、载体与目的DNA克隆片段的制备(一组一份),目的：利用双酶切PCR产物制备载体与目的DNA克隆片段材料：QuickCut-EcoRIQuickCut-HindIIIQuickCut-Buffer,双酶切体系：,混匀上述反应体系，37C水浴60min；酶切产物的纯化：同PCR产物的纯化，最后用25l水洗脱。,四、pET28a-GFP表达载体的构建（一组一份）,目的：学习利用逆转录PCR克隆目的基因以及克隆基因重组表达载体的构建；材料：pET-28a/EcoRI+HindIII：内切酶：EcoRI+HindIII连接酶：Solution IKan平板：DNA酶切/PCR产物纯化试剂盒：,4.1目的基因DNA与载体的连接（一组一份）,连接反应：,室温，连接过夜。,4.2 BL21(DE3)感受态细胞的制备（1人一份）,实验目的：掌握常规的化学法制备大肠杆菌感受态细胞的方法,实验注意事项,接种培养示范；每组一管5ml LB液体培养基；除离心和培养外，所有操作均在超净工作台完成。,2、实验步骤,于超净台中，按1%（V/V）的接种量，即取50 L大肠杆菌BL21(DE3)菌液接种于5mL LB液体培养基中。（一组接种一管）;37摇床培养1.52.0 h至OD600为0.4左右，此时大肠杆菌培养液呈现出一种“雾”状。将装有大肠杆菌培养液的试管置于冰水浴中预冷10分钟。于超净台中，取1.5mL大肠杆菌BL21(DE3)菌液至1.5mL Eppendorf管中，4，4,000rpm，离心5min。（每人做一份）；弃尽上清液，加入1ml预冷的100mmol/L CaCl2溶液，轻弹管壁重悬菌体沉淀，使之混匀，4恒温，4000rpm离心5min。弃尽上清液，加入0.5ml预冷的100mmol/L CaCl2溶液，冰水浴中放置30min。4恒温，4000rpm离心5min。弃上清液，将菌体沉淀用100L预冷的的100mmol/L CaCl2甘油溶液重新轻轻悬浮。置4冰箱保存，次日（4-16hr内）使用。,五、BL21（DE3）感受态细胞的转化(3.12),BL21（DE3）培养物LB培养基100 mM CaCl2Kan平板Kan质粒抽提试剂盒内切酶PCR试剂,5.1 BL21(DE3)感受态细胞的转化,取上次实验连接产物5ul加入到BL21(DE3)感受态细胞（100-200ul）中，轻弹管壁，混匀细胞和连接产物；冰上放置30min；然后将感受态细胞置于恒温金属块中，42 C 热激BL21（DE3）感受态细胞90 sec；取出感受态细胞冰浴5min；加入1ml LB培养基，放入摇床中37 C，220rpm培养45-60min；5000rpm，离心5min；弃去上清1mL余下100 ul菌液重悬，涂Kan平板平板放入37 C生化培养箱中，正置培养30min后，倒置培养过夜（16hr）。次日取出，挑斑接种LB/Kan液体培养基培养（37 C，220rpm）。每人限挑一个斑接种（每组最多4斑）,5.2 pFastBacHTA质粒的制备（一组一份）,方法同pET28a的制备。,5.3重组质粒pFastBacHTA-eGFP的构建（一组一份）,制备pFastBacHTA-eGFP/EcoRI+HindIII连接pFastBacHTA-eGFP+eGFP连接产物转化TG1次日挑斑,六、重组表达载体的鉴定（3.18）,1、目的：学习菌液PCR和酶切鉴定重组质粒的方法2、菌液PCR法3、硅膜法制备质粒DNA4、酶切鉴定重组质粒,6.1 菌液PCR法鉴定重组克隆（一人一份）,挑斑培养约5-6hr后，细菌培养物看起来呈浑浊状，此时通过直接取样用于PCR扩增。取样后，继续培养过夜（16hr）。PCR按如下反应体系操作：,PCR反应条件：94 C,5 min94 C,30 sec55 C,30 sec72 C,1.5min72 C,5minPCR反应结束后，取10ul样品与质粒的酶切产物一起电泳分析，记录实验结果。,30次循环,6.2 重组质粒的抽提（1组2份）,pET28a-eGFPpFastBacHTA-eGFP方法同pET28a,实验步骤,硅膜法抽提质粒DNA,取3 ml 培养过夜的菌液，12,000g,离心1 min，弃尽上清。加250 l S1 重悬细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。加250 l S2，温和并充分地上下颠倒数次混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5 min。加350 l S3，温和并充分地上下颠倒数次，12,000g 离心5 min。吸取步骤4 中离心产生的上清并转移到制备管中（之前置于2 ml 离心管），12,000g离心1 min，弃滤液。将制备管置回离心管，加500 l W1，12,000g 离心1 min，弃滤液。将制备管置回离心管，加700 l W2，12,000g 离心1 min，弃滤液；以同样的方法再用700 l W2 洗涤一次。弃滤液。将制备管置回2 ml 离心管中，12,000g 离心1 min。,取出制备管移入新的1.5 ml 离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加50 l 预热的去离子水，室温静置1 min。12,000g 离心1 min。洗脱下来的溶液即质粒DNA样品。,6.3 酶切鉴定重组质粒（建议1组2份）,为了比较准确地鉴定重组克隆，在PCR鉴定的结果上需要进一步酶切鉴定重组质粒。酶切反应,酶切反应条件方式：水浴；温度：37C；时间：30 min.20ul酶切样品全部用来电泳酶切结束后，与PCR产物一起电泳（制备1%Agarose凝胶电泳检测）。,实验结果与分析,M 1 1a 1b 2a 2b 3a 3b M2,M1:-DNA/HindIIIa:PCRb:质粒酶切产物M2:DL2000,6.4 pFastBacHTA-eGFP转化DH10Bac（一组一份）,每组两块Kan/Tet/Gen/IPTG/X-gal平板和一管DH10Bac感受态细胞；取经PCR和酶切鉴定阳性的pFastBacHTA-eGFP质粒5L(1ng)添加到DH10Bac感受态细胞中，轻弹管壁混匀，勿用移液器吹吸；冰浴30 min；将细胞置于42 C金属浴中热激90 sec;立即转入冰水中冷却2 min;添加1 ml LB培养基，37 C，220rpm培养2 hr;5000rpm离心5min；弃上清，余100L菌液重悬细胞，涂DH10Bac平板；所涂平板经正置培养1 h后，倒置培养48h；,6.5 蓝白斑筛选重组子（3.19）,取出前2日所涂平板；挑取2-3白斑（不含任何蓝色）接种Kan/Gen/Tet LB培养基；37 C，220rpm培养过夜；下次实验时通过PCR鉴定阳性克隆。,七、原核诱导表达eGFP（一组一份）,IPTGSDS-PAGEWestern Blot,7.1 目的基因的诱导表达(一组一份),取经PCR和酶切鉴定阳性的重组克隆，按照1：100比例接种Kan/LB 培养基，即50L 菌液接种5mL Kan/LB 培养基。37C摇床220rpm培养，使菌液OD600达，约5-6 hr.添加IPTG达到终浓度1mM，37 C诱导培养4hr，或者16 C诱导培养过夜。,7.2 SDS-PAGE与Western Blot分析（4.10，一组一份）,本次实验每组一管5ml诱导培养的重组工程菌PAGE凝胶：共4块，2块PAGE后考马斯亮蓝R-250染色，2块用于电转印PVDF膜一抗二抗DAB或TMB显色液,实验步骤,制备样品：一组制一个样品取诱导和未诱导培养液各1.5ml，5000rpm离心5分钟，弃上清；加入100 l PBS重悬菌体沉淀；加入等体积的 2SDS凝胶载样缓冲液，混匀，沸水中煮10min。冷却后12000rpm离心，上清作为样品备用。,于同一电泳槽的两块凝胶中，分别各取10l煮沸处理过的样品上样，120V电泳，待样品进入分离胶将电压调至180V。待溴酚蓝接近凝胶底部约0.5 cm时，停止电泳，卸下玻璃板，取出其中一块凝胶用于考马斯亮蓝R250染色。另一块进行电转印。使用新鲜配置的染色液，于脱色摇床上染色12 小时。弃去染色液，用自来水冲洗凝胶数遍后，用脱色液脱色至背景消失为止。于白色背景透射平板上拍照记录。,用于电转印的凝胶以适量的转移缓冲液室温平衡凝胶10min；按照凝胶大小但各边都比凝胶大1mm剪裁PVDF膜。慢慢将所剪的PVDF膜放入甲醇中，使之浸润约30sec，取出转入去离子水中约1-2min；然后在转移缓冲液中平衡10-15min；剪两张大小与PVDF膜完全一样的Whatman 3MM滤纸，用转移缓冲液浸湿，将其中一张平铺于电转移装置上，然后将凝胶平铺于3MM滤纸，用玻璃棒在凝胶上轻轻滚动，以防中间夹有气泡；,将处理好的PVDF膜平铺于凝胶表面，用玻璃棒在PVDF膜上轻轻滚动，以防中间夹有气泡；将另一张3MM滤纸平铺于PVDF膜表面，用玻璃棒在滤纸上轻轻滚动，以防中间夹有气泡，然后将滤纸/凝胶/膜/滤纸夹层放入电转移装置内，注意凝胶面朝向负极；20mA，电转移数小时或者过夜；电转移完毕后，将膜置于封闭液（含5%脱脂奶粉的PBS）中，脱色摇床上持续摇动，使膜与封闭液平衡30-60min；,弃去封闭液，将膜置于用封闭液适当稀释的一抗溶液中（1:3000），于37C缓慢摇动2h；弃去一抗溶液，将膜转入洗涤液（含0.5%Tween-20的封闭液）中，于脱色摇床上，振荡洗涤5min；弃洗涤液，重复洗膜3次；将膜转移到二抗溶液（用封闭液1:2000稀释的HRP标记的二抗溶液）中，37C下孵育1h；,弃二抗溶液，用洗涤液洗膜三次；用ddH2O漂洗膜一次；将膜浸入DAB显色液（自配）中进行显色10min左右；待显色充分（通常有明显的特异条带）后，弃显色液，用自来水洗膜，终止显色反应；拍照记录；与染色胶进行比对确定显色条带的位置。膜干后，装入密封袋避光保存。,实验结果,SDS-PAGEWestern Blot,SDS-PAGE,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9,Western Blot,Western Blot,八、重组杆状病毒的构建(3.25，一组一份),Sf9细胞转染试剂6孔细胞培养板,8.1 重组Bacmid的制备（一组1份）,取3 mL 过夜培养的菌液加入离心管中，12,000 rpm离心1 min，弃上清。加入300 L Buffer S1(已加入RNase A)，使用移液器彻底悬浮细菌沉淀。加入300 L Buffer S2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解(5 min)。加入300 l Buffer S3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，冰上放置10 min，12,000 rpm离心10 min。将上一步所得上清加入含有800 l异丙醇的离心管中，混匀，冰上放置10 min，12,000 rpm离心15 min。弃上清，加入500 L70%乙醇清洗沉淀，12,000 rpm离心5 min；重复此步骤一次。于生物安全柜中，用移液器吸尽上清，沉淀风干，大约10 min左右。最后40 L ddH2O溶解Bacmid DNA沉淀，4C保存备用。,8.2 重组Bacmid转染昆虫细胞制备重组病毒（一组一份）,转染前，将状态良好的细胞Sf9传代至6孔板中，27C培养过夜，使其在转染时细胞汇合度为50-80%；于1.5 mL Eppendorf管中，加入95 L的SF-900 II SFM培养基和5 L(1 g)的Bacmid，轻弹混匀，室温孵育5 min；加入3L的转染试剂，此时混合物总体积为103 L，轻弹混合物充分混匀，室温下孵育15 min；逐滴法将混合物加入细胞培养液中，轻轻晃动培养板，确保混合均匀；将培养板置入培养箱中，27 C条件下培养，2日后于荧光显微镜下观察细胞形态、密度及发荧光情况，并拍照记录结果；,九、慢病毒的组装（一组一份）,重组慢病毒载体：pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-RFP（CD511B-RFP）辅助质粒：pLP1,pLP2,pLP-VSV-G,慢病毒包装细胞:293T,293TN等转染试剂,慢病毒表达载体,慢病毒包装载体ViraPower Packaging Mix,慢病毒的作用机制,9.1 慢病毒的包装,RFP,9.1 慢病毒的包装,于35mm的细胞培养皿中铺种1 106个293T细胞，37C和5%CO2条件下培养使之在转染前达到90%的汇合度。取1.5g的511B-RFP质粒DNA与1.5g的ViraPower Packaging Mix混合后稀释到0.5mL无血清的DMEM中混匀。10L 的转染试剂稀释到0.5mL无血清的DMEM中，分别室温孵育5min。DNA和转染试剂的稀释液混合起来，室温孵育20min以形成DNA和转染试剂的复合物。将DNA-转染试剂复合物逐滴添加到35mm的细胞培养皿中转染293TN细胞。37C和5%CO2条件下培养48hr后，于荧光显微镜下观察细胞发荧光情况，并拍照记录结果；,十、荧光观察（3.29）,观察重组杆状病毒感染的细胞状态观察慢病毒载体转染的细胞状态地点：6#402；时间：集中分时段，下午2点-4点；5min/每组4-5人；,课程考核,平时出勤实验报告:GFP原核表达GFP重组杆状病毒的构建与表达RFP慢病毒的包装注：要总结技术路线；实验报告以A4纸装订提交；4月9日前（含）交与刘轶轩。,