《分子杂交技术》PPT课件.ppt
A,C,G,T,分子杂交技术,基因公司技术讲座,*分 子 杂 交*,分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物分子（探针）的一门技术。,分 子 杂 交 原 理 及 流 程 图,样 品 制 备,电 泳,杂 交,转 膜,结果显示,探 针 制 备,*分 子 杂 交 分 类*,Southern Blot-DNA杂交,Northern Blot-RNA杂交,Western Blot-蛋白质杂交,原 位 杂 交,*样 品 制 备*,DNA 纯 化,RNA 纯 化,*探 针 制 备*,随机引物法合成高特异活性的DNA探针NEBLotKit,特 点：*活性高：109 dpm/ug*标记效率高：可用于5 ng-2 ug的模板DNA量,模板量,用 途,基因文库筛选Southern 杂交Northern 杂交原位杂交,随机引物法双链DNA探针合成标记优化技术 DECAprimeTMII Random Priming DNA Labeling Kit,优化技术：*高纯度无外切酶活性的 Klenow酶提高了标记效率 10分钟完成反应*改进的标记动力学增加了探针产量 对低纯度及低浓度模板也能通过延长反应时间达到目的*独特的Decamer溶液提高引物-模板复合物稳定性 减少引物双体形成，提高了灵敏度*标记灵活：提供 dATP和 dCTP 两种标记缓冲液,特异性单链DNA探针合成标记优化技术 Prime-A-ProbeTM Strand Specific DNA Probe Synthesis Kit,活 性 大 于 4 cpm/ug,109,合成高特异性全长RNA探针的最佳选择 MAXIscriptTM 体外转录试剂盒,特 点：*可合成长达2kb的RNA*产量可达2-4ug/ul 同位素标记可达109 cpm/ug*对应不同的启动子有不同的试剂盒可供选择*同位素或非放标记均可,多次洗脱反复杂交探针制备技术 Strip-EZTM System,专门为需要在同一张膜上反复标记检测不同信号的用户设计，提供非常温和的杂交信号洗脱条件，提高膜的使用寿命达通常的三倍左右。,工 作 原 理合成探针的同时掺入经过修饰的dNTP(修饰不影响杂交特性）杂交检测后将膜浸入探针降解缓冲液中将探针降解68温和洗脱适用于：NorthernSoutherndot/slot及相关杂交,Strip-EZTMRNA探针合成Strip-EZTMRNA Probe Synthesis&Removal Kit,特 点：*灵敏度高 比随机引物法DNA探针灵敏10倍以上*温和洗脱，提高膜寿命*不同启动子有不同试剂盒*同位素和非放标记均可,效 果 比 较,PCR 法Strip-EZTMDNA探针的合成Strip-EZTM PCR Stripable DNA Probe Synthesis&Removal Kit,特 点：*模板多样：克隆序列、cDNA、PCR产物*不对称PCR技术，产物大多为单链DNA探针*灵敏度高，比随机引物法高3-5倍*提供除模板、标记物、Taq 酶外所有合成探针 及洗膜试剂，包括M13正反向及T7引物,结 果 比 较,cDNA,dsDNA,ssDNA,ssRNA,Oligonucleotide,ssRNAssDNAdsDNAOligonucleotide,Probe Type,*标 记 类 型*,放射性同位素标记：灵敏度高，成本低 但操作不便，标记效率不太稳定，寿命受半衰 期限制 非放射性标记（地高辛、生物素、荧光素等）：安全，标记稳定，探针寿命较长 但灵敏度较低，背景较高，成本高,非 放 射 性 杂 交 系 统BrightStarTMPsoralen-Biotin Nonisotopic labeling Kit&BioDetectTM Nonisotopic Detection Kit,灵敏度最高的非放检测系统之一BioDetectTM Nonisotopic Detection Kit,采用的化学发光剂CDP-Star为发光最强、发光时间最长的化学发光底物之一，灵敏度与同位素相当。*曝光10-30分钟相当于32P压片1-2天*发光时间稳定持续2天，发光峰值无明显下降 允许反复多次压片*背景很低,Phototope 化 学 发 光 系 统NEBlot Phototope Kit&Phototope-Star Chemiluminescent Detection Kit,Northern 杂交Southern 杂交Phage文库筛选菌落及质粒文库筛选,用 途,原位杂交及检测试剂盒mRNAlocator-HybTM In Situ Hybridization KitmRNAlocator-BiotinTM mRNA In Situ Detection Kit,6小时完成杂交RNasecure 保证无RNase污染高效灵敏的NBT/BCIP-生物素探针显色检测提供对照,改良的Northern杂交技术Ambion 公司的Northern杂交系列,完整的Northern杂交试剂盒,包括从琼脂糖、上样、配胶、电泳、转移缓冲液到杂交、洗膜液，除RNase、膜、Marker的全套试剂。简便、无污染、背景低、分辨率高；同位素、非放标记均可,杂交用琼脂糖及聚丙烯酰氨凝胶电泳胶专业厂家：BMA公司,Agarose&PAGE 预制胶 Reliant gel system Reliant RNA gel system PAGEr Precast gels,NEB公司各种规格的优质DNA/RNA/Protein MW Markers,Protein Marker,Broad Range(2-212kDa)Prestained Protein Marker,Broad Range(6-175kDa)HRP Protein Marker Detection Pack,世界标准杂交膜Schleicher&Schuell 公司产品,*Protran硝酸纤维素膜*OptitranBA-S加强型硝酸纤维素膜*Nytran尼龙膜*NytranSuPerCharge 高负荷正电荷尼龙膜 单位面积所带正电荷是普通膜的3倍 大大降低了背景及非特异性结合 膜孔径、表面均一性、对称毒度、洁净度好,分析基因差异表达的预制杂交膜,热点领域中基因的cDNA点阵,各种来源的mRNA,CLONTECH公司的高效杂交液ExpressHyb Hybridization Solution,特 点：通过升高杂交温度并使用修饰的杂交液不仅将杂交时间由传统的12-24小时减为1-2小时，还大大降低了非放标记检测的背景。特别适用于Northern杂交检测低拷贝RNA和 Southern杂交检测单拷贝基因,新 型 方 便 的 除 RNase 试 剂,RNaseZAP RNase Decontamination Solution 一种能完全去除玻璃、塑料表面RNase污染的喷雾剂ElectroZap 还可除电极及pH计等表面的RNaseRNAsecure 比传统的DEPC使用安全、简便 无须灭菌等后续处理，不影响RT-PCR、体外转录等后续实验RNAlater 最方便的样品贮藏液 5倍体积即可抑制组织中的RNase 稳定的样品可：室温保存一周，4保存一月，-20 长期保存不冻结 样品类型：组织（骨除外）、植物、大肠杆菌、果蝇、鱼等,分子杂交实验所用部分仪器,杂交箱 紫外交联仪 同位素检测仪 水浴及摇床 电泳及转膜装置,快速毛细管转移装置S&S公司的TurboBlotterTM,特 点,快速：碱性转移液：1小时中性转移液：4小时经济：节省转移液及相关用品,谢 谢 各 位 老 师！,基 因 公 司 技 术 讲 座,
