《分子克隆》PPT课件.ppt

基因工程 Genetic Engineering,李黄金Email:生命科学与生物制药学院9,基因工程课程内容,5,2,3,4,1,6,7,8,9,基因工程概论,分子克隆单元操作,大肠杆菌基因工程,非肠道细菌基因工程,真菌基因工程,昆虫基因工程,高等动物基因工程,高等植物基因工程,蛋白质工程、途径工程,第二章 分子克隆单元操作,2.2,2.3,2.1,用于基因克隆的载体,DNA的体外重组（切与接）,目的基因的克隆,2.4,基因操作常用技术,转化与扩增（转与增）,转化子的筛选与重组子的鉴定（检）,2.5,2.6,2.1 用于基因克隆的载体,质粒载体,噬菌体或病毒载体,考斯质粒与噬菌粒,人工染色体载体,载体的基本概念,一、载体的基本概念,载体（Vector）：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。,2、载体应具备的条件,1、载体的主要功能,3、载体的类型（重点）1）按功能分；2）按传代特性分；3）按来源分,二、质粒(plasmid),质粒的生物学特性（几个基本概念）严紧型/松弛型；不相容性；氯霉素扩增,质粒载体的特点与类型（关键元件、特点）,重要的质粒载体（pUC18/19；T载体）,质粒的制备与鉴定（碱裂解法、几种质粒构象在琼脂糖电泳中的位置）,选择性标记：供转化子/重组子筛选用的遗传标记基因,多克隆位点（MCS）供外源基因插入的、由单一切点内切酶识别位点组成的序列,质粒载体关键元件：复制位点、选择性标记、多克隆位点,复制位点：供自主复制用的由复制起始位点和调控基因组成的短序列,（三）重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,1、pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/cell,用于基因克隆,2、pUC18/19：最优秀的常规克隆载体,拷贝数 2000-3000/cell,用于基因克隆和测序，T载体的母载体,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,碱裂解法：最常用,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染,色体DNA及大部分蛋白质,离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA,用无DNase的RNase去除残余的RNA,cccDNA,L-DNA,ocDNA,三、噬菌体或病毒DNA,噬菌体：细菌的病毒，常开发为克隆载体病毒：动、植物的病毒，常开发为表达载体,共同特点：,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增可在裂解和溶原二种状态间转换（可作筛选标记）,l 噬菌体的基因组结构,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,Cos位点（12bp）,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l-DNA,体外,体内,COS位点,l 噬菌体的感染周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,噬菌体的lamB受体：麦芽糖转运蛋白，,l 噬菌体的体内包装 包装范围为原DNA（48.5kb)的75-105%：36-51 kb,体内包装,100个左右的拷贝,包装范围为原DNA的75-105%,即 36-51 kb,D,A,串连多聚体,经滚环式复制形成串联重复,l 噬菌体的溶原状态,l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶原状态 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态,2、l-DNA载体的构建：体外有效包装是关键标准1）缩短长度：按有效包装范围确定,野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,插入型l-DNA载体：载量为0-14KB,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度 37 kb,插入片段大小：,0-14 kb,（51 37）,按尺寸能在体外有效包装是关键,取代型l-DNA载体：载量为10-25kb,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb,（51 26）,载体长度 26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb,（36 26）,按尺寸能在体外有效包装是关键,2）删除重复的酶切位点，引入多克隆位点,野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点,3）加装选择标记,与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容,l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,免疫功能类标记,颜色反应类标记,加装选择标记：imm434（外源基因插入位点）,Imm434：完整 溶原（浑浊斑）；外源基因插入 溶菌(透明斑）基因编码一种阻止l-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑,透明斑,浑浊斑,加装选择标记：lacZ（-互补）,lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化,无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基,因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能,合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产,生蓝色透明斑,4）构建琥珀密码子的突变体（环保的需要）,琥珀型突变（sup)：由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株,3、l-DNA载体的主要类型：,插入灭活型载体,Charon2、Charon6、lgt11,取代型载体,lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40,正选择型载体,lEMBL1、lL47、l1059,野生型的l噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），,这种生长抑制表型受l-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外,源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌,体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑,4、l-DNA重组分子的体外包装：,l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的,5、l-DNA及其重组分子的分离纯化：,将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期,加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时,用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。这时噬菌体颗粒,密度已达1013-1014/L，大肠杆菌细胞已完全裂解,超速离心，沉淀噬菌体,苯酚抽提，释放l-DNA,乙醇或异丙醇沉淀l-DNA,6、l-DNA作为载体的优点：,l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量,重组l-DNA分子的筛选较为方便,重组l-DNA分子的提取较为简便,l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达,外源基因,（二）大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,1、M13噬菌体的生物学特性：,M13噬菌体的外型呈丝状,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,致使比其他区域的宿主生长慢,形成混浊噬菌斑,M13 DNA上至少有10个基因,2700个外壳蛋白分子,M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长,M13噬菌体的感染周期,（+）DNA,RFDNA,RFDNA,RFDNA,-DNA,II,V,2、M13 DNA载体的构建,III VI I IV II X V VII IX VIII,野生型M13RF-DNA,III VI I IV II X V VII IX VIII,M13mp系列载体,lacZ,polylinker,MCS,插入多克隆位点和标记基因,3、M13 DNA载体的特点：,使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在DNA定向突变中非常有用,M13重组分子筛选简便,被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大,但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb,（三）病毒载体,与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病,毒基因组DNA。,动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病,毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：,单链DNA病毒,双链DNA病毒,单链RNA病毒,双链RNA病毒,RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，,这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。,动物病毒载体,(1)具有动物病毒的复制起始位点(2)具有在动物细胞中能表达的选择标记(3)具有大肠杆菌质粒载体的复制起始位点、选择标记和多克隆 位点 目前常用的基因转移载体有：(1)猴空泡病毒(Simian virus 40简称SV40)；(2)腺病毒(Adenovirus)；(3)乳头状病毒(Papilloma virus)；(4)逆转录病毒(Retrovirus);(5)牛痘(Vaccinia)病毒;(6)牛疣病毒(Bovine papilloma virus)等。,考斯质粒（cosmid）,考斯质粒载体的构建：,考斯质粒是一类人工构建的含有,1978年Collins和Hohn发明构建,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,l-DNA cos序列和质粒复制子的,特殊类型的载体,cos site-carrying plasmid,1.8 kb的l-DNA片段+pBR322片段,装载范围为31-45 kb,三、考斯质粒与噬菌粒,考斯质粒载体的特点：,能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞,装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,不能体内包装，不裂解受体细胞,噬菌粒（phagemid or phasmid）,噬菌粒载体的特点：,噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子,以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体,能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞,装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb）,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA,重要的噬菌粒载体：pUC118/119,pUC118 pUC18+M13间隔区 IG,pUC119 pUC19+M13间隔区 IG,500 个拷贝,3200 bp,MCS,lacZ,lacI,ori,Apr,M13-MG,pUC118/119,表示M13辅助噬菌体DNA,滚环复制,重要的噬菌粒载体：pBluescript（体外转录载体）,pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT7,2958 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,f1-ori,pBluescript,PT3,噬菌体启动子PT3和PT7强化外,源基因的转录,提取出来的单链DNA重组分子,在噬菌体RNA聚合酶的存,在下，又可实现外源基因,的体外转录,四、人工染色体载体,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百,甚至上千 kb 的DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载,量也远远不能满足需要。,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳,定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外,源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成人工染色体，,它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,目前常用的人造染色体载体包括：,细菌人工染色体（BAC）,酵母人工染色体（YAC）,酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosomes,YAC）,YAC载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列：TEL,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,酵母染色体的复制子：ARS,酵母染色体的中心粒序列：CEN,酵母系统选择标记：URA3/TRP1,大肠杆菌的复制子:ori,大肠杆菌的选择标记:Ap,YAC载体的装载量为350-400 kb,酵母人工染色体的使用：,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,易于发生重组、缺乏稳定性、制备工艺繁琐,细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上,构建的，其装载量范围在50-300 kb之间,各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝,pBACs主要适用于：,克隆大型基因簇（gene cluster）结构,构建动植物基因文库,细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）,优点：能携带大片段DNA，约300kb保留了与F 因子的自主复制、拷贝数控制以及质粒分配等基本功能相关的基因,2.1 用于基因克隆的载体,质粒载体,噬菌体或病毒载体,考斯质粒,人工染色体载体,几类载体的比较,噬菌粒,大小组成导入宿主方式容量用途,