《凝胶过滤层析》PPT课件.ppt

凝胶过滤层析gel filtration chromatography,GFC,定义,凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析（size exclusion chromatography）、分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗透层析（Gel Permeation Chromatography）,应用,凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。,原理,凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。,带网孔的葡聚糖珠,小分子进入葡聚糖珠内,大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出,固定相（凝胶）,三维空间网状结构,分子筛效应：按分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。,基本概念,外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积,凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）,分配系数（Kd）,Ve=Vo+KdVi,(2)Ve=Vo+Vi，Kd=1分子完全不被排阻完全向凝胶颗粒内部扩散在两相分配的比值为1,最后流出,(1)Ve=Vo，Kd=0分子完全被排阻于凝胶颗粒之外全部分布于流动相里最先流出,(3)0 Kd 1，Ve=Vo+ViKd为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散,每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数,特点：与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关,小分子量,大分子量,典型的凝胶类型,交联葡聚糖凝胶：Sephadex聚丙烯酰胺凝胶：Sephacryl 琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel其它：有机凝胶Sepharon，交联聚醚Toyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等,葡聚糖凝胶,葡聚糖凝胶（Sephadex）具有良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中最常用的凝胶。基本骨架：葡聚糖（dextran）;交联剂：3-氯-1,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大,Sephadex G系列凝胶的分级范围 G10 700 DG15 1,500G25 1,000 5,000G-50 1,50030,000G-75 3,00070,000G100 4,000 150,000G150 5,000 400,000G200 5,000 800,000,交联葡聚糖凝胶的化学结构,葡聚糖凝胶,1理化性质葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒。它带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。由于各种型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，致使如下理化性质在水中的有明显的差异：膨胀度(床体积)吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量)筛孔的大小 分级范围葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不一样,分类,以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析。以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N-二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析。,2稳定性 葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120)消毒0.5h，其性质并不改变。在0.1molL HCl溶液中浸泡12h，甚至在0.02molL HCI溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触。葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、0.05NaN3或20乙醇等，不然微生物将生长。,3吸附性 葡聚糖凝胶系弱酸性物质，这是由于其每克干胶中含10-20g当量的羧基基团所致。羧基基团能与分离物中电荷基团(尤其是碱性蛋白质)发生吸附作用。这种吸附作用可以借助提高洗脱液的离子强度得以克服。当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力了。因此，常用含有NaCl的缓冲液作洗脱液。,琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose),琼脂糖是从琼脂中分离出来的。在制备过程要将其中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除去，得到不带电荷基团的琼脂糖。琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链。这种多糖链在100左右时呈液态，当温度下降到45以下时呈固态。它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。,该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力，在的缓冲液中是稳定的。琼脂糖凝胶室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝胶。琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂，故一般存放在含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动。琼脂糖凝胶按其浓度来分有Sepharose 2B(2)、4B(4)和6B(6)。Sepharose 6B的机械强度大于2B，但是筛孔小于2B。,琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好。用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些。大孔凝胶，工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限可分离MW40万以上的物质可用来分离核酸及病毒,三、聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝胶的商品名称为Bio-gel。它是以甲撑双丙烯酰胺(双体)作交联剂，以过硫酸铵作催化剂，在N,N,N,N,-四甲基乙二胺(TEMED)加速剂的作用下，将丙烯酰胺(单体)聚合而成的。当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产物。,凝胶过滤层析实验技术,1、凝胶的选择2、凝胶的预处理3、装柱4、样品的准备5、上样6、洗脱和收集7、凝胶的再生及保存,凝胶过滤层析实验技术,1、凝胶的选择选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）、理化稳定性、强度、非特异吸附性质等。对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。,类分离,目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组分选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0，小分子的Kd1。这样能取得最好的分离效果。,例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下列哪种凝胶最合适？,B.Sephadex G-25（分级范围，1000-5000 D）,A.Sephadex G-15（分级范围，1,500 D）,C.Sephadex G-150（分级范围，5,000-400,000 D）,凝胶粒度的影响,凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70m左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150m左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好,同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果,2、凝胶的预处理,溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上或将干胶加入水里，边加边搅，然后放到沸水浴中加热接近100，保持数个小时。根据干凝胶的填充体积计算所需的干凝胶量平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同（使凝胶溶胀状态稳定）,3、装柱,一般选用细长的层析柱作凝胶过滤。进行类分离（如脱盐）时，柱高50cm比较合适；分级分离时，100cm较为合适具体步骤为：将层析柱垂直固定，一般是先在柱内装入约1/3高度的水或缓冲液排走空气；将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4-1/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度。用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使凝胶介质充分平衡，柱床稳定（若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略）。,层析柱（a）自制简易层祈柱（1玻璃管；2.橡皮塞；3尼龙网）；（b）普通商品柱；（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3柱床；4恒温水进口；5恒温水出口；6可调节的塞子）,4、样品的准备,样品的粘度：粘度大产生介质吸附，一般要求样品粘度小于0.01Pas样品的浓度：样品浓度以不大于4为宜，样品浓度过大往往导致粘度增大。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱样品的体积：分析用量一般应低于总柱体积的5%，制备用量一般为15%或更多（20-30%）。,样品黏度对洗脱曲线的影响,（1）加葡萄糖2 000，使终浓度为5%，相对粘度11.8;（2）加葡萄糖2 000，使终浓度为2.5%，相对粘度4.2;（3）加葡萄糖2 000，使终浓度为1%.,5、上样,具体步骤为：打开层析柱下端出口，使缓冲液流出至刚好达到凝胶胶面沿柱壁缓慢加入样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁加样时应尽量减少凝胶床面的搅动。加样的方法可以是直接将样品加到层析床表面，或可用微量泵控制,6、洗脱和收集,打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。,洗脱时应注意的问题：流速不宜过快且要稳定洗脱液的成分也不应改变（凝胶溶胀程度）整个洗脱过程中始终保持一定的操作压可以用水或缓冲液作洗脱液,流速对洗脱曲线的影响,流速较低，分辨率较高,常用恒流泵控制,7、凝胶的再生及保存,再生 用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能，或参照凝胶产品说明书凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%双氯苯双胍己烷,应用：测定相对分子质量,标准曲线法 对于特定的测定系统，先以3个以上（越多越好）的已知分子量的标准蛋白（目前已有配套标准蛋白系列产品出售）过柱，测取各自的Ve值。以Ve作纵坐标，LogM作横坐标制做标准曲线。在同一测定系统中测出未知物质的Ve值便可由标准曲线求得分子量。分子量在10 000150 000之间的球形蛋白用此法测出的分子量误差在10左右,标准曲线,凝胶过滤层析的特点,优点：操作条件温和，样品回收率可接近100，并且重复性高。作为脱盐手段，与透析法相比速度快、精度高；与超滤法相比，蛋白活性收率高；分离机理简单，操作参数少，容易规模放大缺点：分辨率不高，对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离料液处理量小，并且样品粘度不宜太高分离操作较慢，由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，流速过快会降低分辨率,Thank You!,