《凝胶层析》PPT课件.ppt

层 析,CHROMATOGRAPHY,掌握：凝胶的结构与性质 凝胶层析的基本原理 装层析柱的过程及装柱要求熟悉：层析技术的分类 凝胶层析的特点 层析的概念、一般原理了解：凝胶的选择 柱、样品、洗脱液的选择 凝胶的保存,一.概述,层析Chromatography(色谱),利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异(溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附能力、分子亲合力等)，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。,层析法进行时有两个相，一个相称为固定相(Stationary phase)，另一相称为流动相(Mobile phase)。由于各组分所受固定相的阻力和流动相的推力影响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组分得到分离。,二.层析技术的分类,1.按两相所处的状态分类 以液体作为流动相的层析称为液相层析，以气体作为流动相的称为气相层析。其固定相也可有两种状态，一种是以固体作为吸附剂的固定相，另一种是以涂布在固体载体表面的液体作为固定相。,层析,气相层析（gas-chromatography）,液相层析（liquid-chromatography）,气-固层析（gas-solid chromatography）,气-液层析（gas-liquid chromatography）,液-固层析（liquid-solid chromatography）,液-液层析（liquid-liquid chromatography）,2.按层析过程的机制可分为.吸附层析(adsorption chromatography)-利用吸附剂对不同组分吸附 能力的不同加以分离的方法。.分配层析(partition chromatography)-利用不同组分在流动相和固定相中的 分配系数不同而进行分离的方法。,.离子交换层析（ion-exchange chromatography）-利用离子交换剂与各组分之间的离子亲和 力不同而进行层析分离的方法。.凝胶层析（gel chromatography）-利用不同组分之间分子大小不同，在通过凝胶介质时所受到的阻滞作用的差异而进行分离的方法。.亲和层析（affinity chromatography）-利用生物大分子之间特有亲和力的不同进分离纯化的方法。,3.按操作技术形式分类.柱层析（colum chromatography）-将固定相装在层析柱中，使样品 朝着一个方向移动，通过各组分随流动相流动而得到分离的方法。,纸层析（paper chrmatography）-用纸作为液体的载体，样品点在 纸上随后展开达到分离鉴定的 方法。.薄层层析（thin layper chromatography）-将适当的吸附剂在玻璃板或 其他材料薄板上铺成薄层，样品 点在上面随后用流动相展开达 到分离鉴定的方法。,三.层析的一般原理,二、塔板理论 最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。,凝胶层析 Gel Chromatography,一、定义,凝胶层析是按照被分离物质分子大小,经过具有一定孔径的多孔物质进行分离的一种方法。其又称为凝胶过滤或分子筛过滤或排阻层析。,主要机理是分子筛效应,当被分离物质流经凝胶柱时,因各组份的分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。,二.基本原理,流动相（洗脱液）固定相（凝胶）原理：被分离物质中各组分的分子量不同。,进入具有一定孔径的凝胶柱后,较大的分子不能进入凝胶孔隙中,被排阻在外,而较小的分子则能进入凝胶孔隙,加入洗脱剂后,大分子就随洗脱剂从凝胶间隙洗脱下来,受到的阻力小,其流速较快,小分子物质从上一层凝胶孔隙中出来又扩散到下一层凝胶孔隙中,这样多次反复,大分子物质先从柱中流出,小分子物质后流出。,小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留,大分子被排阻在凝胶颗粒外面,在颗粒之间迅速通过。,三、常用术语,1固定相固定相是由层析基质组成的。其基质包括：固体物质(如吸附剂、离子 交换剂)液体物质(如固定在纤维素 或硅胶上的溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。,2流动相 在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。在柱层析时，流动相又称洗脱剂或洗涤剂(即推动有效成分或杂质向一定方面移动的溶液)。在薄层层析时，流动相又称展层剂。,3层析 以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。,4操作容量 即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量；一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。(mmol/g,mg/g,mmol/ml,mg/ml)其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之。,5床体积(Vt)通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(Vt)。Vt是基质的外水体积(V0)和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总和，即:Vt=V0+Vi+Vg(详见图3-1),6洗脱体积(Ve)洗脱体积是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。用Ve表示(见图3-7中OB)。,Ve=V0Kav(),7外水体积(V0)外水体积指基质颗粒之间体积的总和。8内水体积(Vi)内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。9基质体积(Vg)基质体积是指基质自身所具有的体积。V0、Vi、Vg都是随着床体积和基质性质变化而变化的。,+,凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径较一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而小分子化合物则可以在筛孔中自由扩散和渗透。某种组分凝胶层析柱中被排阻的程度用分配系数 表示,洗脱体积；外水体积；凝胶床体积,在一定层析条件下，和 均为固定值，而 随着被分离物分子量的变化而变化。组分分子量越大，则洗脱更容易（排阻越多），越小，越小,各组分间的 值差异越大，分离效果越好；差异越小,则分离效果很差，或根本无法分离 流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并相同组分的各管流出物，得到分子量不同的各种组分,1、当Kav=0时，则Ve=Vo，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质全排阻，洗脱体积等于空隙体积即外水体积（图中组分）2、当Kav=1时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内水体积之和。Ve=Vo+Vi（图中组分）,3、当0Kav1时，Ve=Vo+Kav（Vi Vg）。表示固定相中只有一部分可被组分扩散渗入，一部分被排阻，Ve即在Vo与Vo+ViVg之间变化（图中组分）,4、有时Kav1，表示凝胶对组分有吸附作用（从内水中洗脱出来的含量下降），此时VeVo+ViVg。例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在Sephadex G-25中的洗脱体积远超出理论计算的最大值,10膨胀度 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积用V表示。即每克溶胀基质所具有的床体积。V=Vt/g 一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大。,三.凝胶层析的特点,（一）优点,1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结 构稳定,所以凝胶本身不与样品发生化学反应。2.凝胶层析的操作条件较温和,不易引起生 物物质的变性,即使用来分离一些理化性 质不稳定的物质也很少被破坏。3.样品得率高,重复性好.如果按比例扩大柱 的体积和高度,可进行大量样品的分离纯 化。,（二）缺点,1.要求样品和洗脱液的粘度很低。2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被 纯化的物质的分子量范围受到限制。3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用,如 芳香族化合物与脂蛋白等。,四.凝胶的结构与性能,1.葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）结构：葡聚糖用交联剂1-氯代-2,3-环丙烷使葡聚糖之间通过醚键(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交联 聚合而成的三维空间网状结构。,OH,1.特点：Sephadex 的三维空间网状结构的网孔大小取决于交联度,交联度的大小可在合成Sephadex 时控制加入交联剂的百分比决定.交联剂的百分比高,交联度大,网状结构愈紧密,孔隙愈小,吸水后膨胀也愈小,机械强度高,分离物质的分子量也小。反之,交联剂的百分比低,分离物质的分子量大。G类Sephadex的型号表示每克干凝胶吸水量x10,如G-50表示每克干凝胶吸水量为5ml。Sephadex的化学性质稳定,不溶于水、盐、弱酸和碱,耐热耐碱不耐酸。,2稳定性 葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120)消毒0.5h，其性质并不改变。在0.1mol/L HCl溶液中浸泡1-2h，甚至在0.02molL HCl溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。但是，当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触。,3吸附性 葡聚糖凝胶系弱酸性物质、这是由于其每克干胶含1020ug当量的羧基基团所致。该基团能与分离物中电荷基团(尤其是碱性蛋白质)发生吸附作用。当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力了。因此进行葡聚糖凝胶层析时，常用含有NaCl的缓冲液作洗脱液。,2.琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)它是一种大孔凝胶,其工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限,可分离MW40万以上的物质,因此可用来分离核酸及病毒。琼脂糖凝胶不带电荷,不受微生物作用而降解,但对热不稳定,易受pH影响(只在pH4.5-9.0范围内稳定.,琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好，分离范围大。用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些。最好使用条件控制在pH 49之间，温度040，超出此范围,可能被破坏。,琼脂糖凝胶规格,瑞典和国产的产品有3种规格：Sepharose 2B、4B、6B分别表示琼脂糖浓度为2%、4%、6%。,美国的为BioGA，有6个型号:即Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。,3.聚丙烯酰胺凝胶使用范围及效果同葡聚糖凝胶相似,但化学性质较葡聚糖稳定,可在pH2-11范围内使用.聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶P（Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。,聚丙烯酰胺凝胶的结构,单体丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，并以干凝胶形式出售，使用时必须溶胀。稳定性：该凝胶不溶于水和普通有机溶剂，能忍受浓的盐、尿素和胍盐等溶液的浸泡；在PH1-10或短时间超过此pH范围的溶液中较稳定，要避免长期与强酸和强碱接触，如果与其接触并在高温条件下，酚胺基将迅速发生分解。,物理化学性质,吸附性：聚丙烯酰胺凝胶对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附现象，如使用离子强度略高的洗脱液操作，此弊病可以克服。不为微生物利用，易保存。,4、Sephacryl,Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价交联制成的，此凝胶属硬性凝胶，它具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团。Sephacryl吸水时，其珠状颗粒直径为25-75um，通常是用于水相系统中。若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化。,化学性质稳定：它在所有的溶剂中不溶解，化学降解也很少；它可在pH211范围内使用，当pH低时，葡聚糖链发生少许水解作用；在0.2mol/LNaOH溶液中(室温)处理100h，对其低流速和多孔性没有明显影响;用去污剂(如SDS)、6mo1L盐酸胍和8mol/L尿素溶液可作为洗脱剂，高温(120)消毒(pH7.0时)处理后，层析性质没有明显变化。S-100/200/300/400/500;HR200/300/400/500,5、Superdex,Superdex是由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成的。该凝胶具有良好的分子筛特性和物理、化学稳定性。在用其分离样品过程中，溶液的酸碱度可在pH3-12范围内变化，溶液中加入去污剂(如1SDS)和(或)解离剂(如8mol/L尿素、6molL盐酸胍)时，也不会影响分离效果。适合作大规模生产凝胶层析的填料。缺点：对蛋白质有吸附能力。,6.凝胶的选择 选择何种凝胶以及它的型号,这需要根据实验条件,溶质的分子量的大小和分离工作的目的而定,每种型号凝胶都有一定分离溶质分子量的范围,选择的型号凝胶要能满足实验要求。,六.其它条件选择,1.柱的选择 层析的长度（L）与直径（D）之比（L/D）对层析分辨率有影响,一般对用于组别分离的层析柱其L/D为1518：1,层析柱的体积一般大于样品体积的410倍,这类常用于脱盐.对于分级分离可采用L/D 40：1,甚至100：1,层析柱体积一般大于样品体积的25倍。柱短而粗,则易使样品稀释,柱长而窄,则柱的管壁效应较大,会造成拖尾现象。,2.样品的选择：量适当,粘度小。3.洗脱液的选择：每种样品分离所用的缓冲洗脱液应根据使样品稳定的原则使用。,七.应用,1.分离纯化 2.脱盐 3.测分子量 4.高分子溶液的浓缩,凝胶层析法分离蛋白质,操作,1.装柱：在层析柱的底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占体积的1/3时，关闭下端出口，自顶部缓缓加入已处理好的Sephadex G-50悬液，待底部凝胶沉积12cm时，再打开出口，凝胶加至凝胶沉积离层析柱口约3cm即可。,装柱注意点：不得有气泡和分层；凝胶表面应平整；柱床体积稳定；不能让凝胶表面露出水面。,凝胶柱的鉴定 新装的吸附柱用适当的缓冲液平衡后，将带色的蓝色葡聚糖-2000、或者红色葡聚糖、细胞色素C、血红蛋白等物质配成2mg/ml的溶液过柱，观察色带是否均匀下降，如均匀下降，则表明柱中凝胶是均匀的，或者说柱中没裂缝和气泡，是可以使用的，否则就须重新装柱。,2.加样：取样品液5滴即为上柱样品。将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面，注意尽量不要使平整的床表面搅动，然后打开出口，让样品进入床内，直至床面恰好露出，用上法不断加蒸馏水洗涤，立即用试管收集，待红色流尽，换试管收集。,加样量与层析柱床体积及检测方法的灵敏度有关。床体积越小、方法灵敏度越高时，加样量越少 层析的目的在于分析时，加样量占床体积的12，作制备、脱盐用时，占2030 一般来说，加样量越少，分辨率越高。具体加样体积由分配系数(Kav)或洗脱体积(Ve)来决定,加样量,VeA、VeB：组分A、B的洗脱体积 KavA、KavB：组分A、B的分配系数 Vs：A、B两组分的洗脱体积之差（又称为分离体积）Vs=VeA VeB当样品体积VpVs时，理论上的洗脱图形是两种物质恰好分开(图中)。但由于样品流过柱时的扩散作用，其体积会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大,加样量（Vp）的确定,图、中A、B两种物质有一定程度的交叉，这表明二者只是部分分开。因此，当Vp等于或大于Vs时，A、B两种物质就不能完全分开(图中)当VpVs时，A、B两种物质就能分开(图中)根据 Ve=Vo+Kav（Vi+Vg）又 Vs=VeAVeB=（KavAKavB）（Vi+Vg）,A、B两种物质能分开的最低限：VpVs最大Vs时的必要条件：KavAKavB 最大，为101 Vi+Vg最大，一般为Vt/2则：最大理论加样量VpVsVt/2,最大理论加样量的计算,粘度对柱层析的影响,样品与洗脱液的黏度相当为宜,流速对洗脱曲线的影响,3.洗脱,4、凝胶柱的再生及保存（1）、再生 仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后即可再次使用；但使用过多次后，由于凝胶床体积变小、流动速度降低或污染杂质过多等原因，致使其正常性能受到影响。在此情况下，如欲重复使用，就须进行再生处理。方法是：先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进行平衡，平衡毕，即可重复使用；另一种方法是，把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行，处理后重新装柱即可再行使用。,（2）保存方法：,湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入适量的防腐剂如氯仿、0.05NaN3或20乙醇等，不然微生物将生长。干法：用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收缩，再抽干乙醇，用60-80的暖风吹干，在室温下保存。半缩法：是过度法，用60%-70%的乙醇使凝胶部分脱水，然后封口，4 保存。,凝胶过滤层析经常遇见的问题,1流速慢（1）有气泡、出水管阻塞（2）硅胶层堵塞（3）柱压太紧（操作压过大、长期使用、接头漏气）2柱内产生气泡（1）上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流（2）接口漏气，如上水口螺丝拧的不紧,3条带扭曲（1）胶面不平（2）样品或洗脱液中有颗粒（3）装柱不均匀4分辩率不高（1）装柱不均匀（2）样品量过大（3）流速太快（4）柱不垂直或柱不合适（5）长菌（6）柱下口软管太长（7）胶不适当,原理：盐类小分子物质进入凝胶筛孔，而大分子物质则被排阻在外（分子筛原理）优点：与透析相比，速度快，不会引起大分子物质变性材料：细颗粒葡聚糖凝胶G-25,二、脱盐和浓缩,原理：Kav=b lgM+c 或lgM=adKav(M为分子质量，常数a、b、c、d均大于0)先做标准曲线，再在相同条件下测样品Kav 也可用以下4个指标代替VeVo：分离体积Ve/Vo：相对保留体积（另R Vo/Ve）Ve/Vt：简化的洗脱体积，受柱的填充情况的影响较小 Ve：洗脱体积 lgM=abVe 特点：简便实用，所需样品量较少,三、测定分子质量,pH68的范围内，曲线线性才比较好；而在极端pH时，由于变性等原因易偏高 一般适用于球状pro的分子量测定，而纤维状pro不合适糖蛋白中若糖的比例5时，测定结果偏大不受变性剂如尿素和盐酸胍的影响有些酶类不适用。如淀粉酶，能与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在凝胶层析时有异常反应,用凝胶过滤法测定分子量的局限性,2003年中科院考研题,今有a、b、c、d四种蛋白质，其分子体积由大到小的顺序是abcd，在凝胶过滤柱层析中，最先洗脱出来的蛋白质一般应该是（）A、aB、bC、cD、d,2000年中科院考研题2003年上海师范大学考研题,指出从分子排阻层析柱上洗脱下来下列蛋白质时的洗脱顺序，为什么？分离蛋白质的范围是5,000-400,000。肌红蛋白（马心肌）16900过氧化氢酶（马肝）247500细胞色素c（牛心肌）13370肌球蛋白（鳕鱼肌）524800糜蛋白酶原（牛胰）23240血清清蛋白（人）68500,1在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为140ml，其外水体积和总体积分别为60ml和200ml，求分配系数是多少?,思考题,解：Ve=Vo+Kav（Vt Vo）140=60+Kav（200 60）Kav=0.57,解：最大理论加样量 Vp=Vs=Vt/2=3.14(5.0/2)2 60/2=589ml,思考题,2在5.0cm60cm的凝胶柱中脱盐时，就理论值而言，最 多加样体积是多少毫升?,