《克隆抗体》PPT课件.ppt

第一节 动物细胞制药基础知识,一、动物细胞的结构,细胞膜细胞质细胞核亚细胞器无细胞壁,第十二章 单克隆抗体,二、动物细胞代谢,葡萄糖和谷氨酰胺提供能量和合成代谢的前体葡萄糖 受限 谷氨酰胺谷氨酰胺：氮源，受限，消耗其他氨基酸葡萄糖代谢：进入糖酵解途径，大部分分解为丙酮酸 乳酸，分泌到胞外（积累）丙酮酸还可以转化为乙酰辅酶A，进入TCA循环，彻底氧化为CO2和水 4%-8%的少部分葡萄糖进入五糖磷酸途径PPP，转化为4、5、7碳糖和NADPH.5碳糖用 于核酸合成，其他中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。葡萄糖代谢旺盛，产生大量乳酸，产生细胞毒性。,谷氨酰胺代谢：进入氨基酸代谢途径，合成其他氨基酸 大多数谷氨酰胺在脱氨酶作用下，生成谷氨酸，并释放氨，产生细胞毒性 小部分谷氨酰胺通过转氨作用生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖。谷氨酰胺 谷氨酸还原酶-酮戊二酸 TCA 能量 在快速生长的培养系中，转氨作用是主要代谢途径：谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发生转氨作用 丙氨酸和天冬氨酸葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸常流加葡萄糖代谢和谷氨酰胺，控制整个代谢，避免有毒废物积累,三、动物细胞的分类,原代细胞（primary cell):从动物体内直接分离得到的细胞 特点：生长分裂不旺盛，与体内细胞相似 传代细胞（passage cell):原代细胞转接后培养的细胞 特点：分裂增殖旺盛二倍体细胞系（diploid cell):原代细胞经过传代、筛选、克隆、纯化后，获得的具有一定特征的细胞系。如：W1-38,MRC-5,ZBS等有限细胞系(finite cell):生长和寿命有限的细胞系，二倍细胞系 特点：多次传代培养，失去增殖能力，老化死亡（寿命取决于细 胞来源的物种、年龄和器官）人细胞：50-60代，胚成纤细胞：人 50代；鸡胚 30代；小鼠 8代,三、动物细胞的分类（二）,无限细胞系(infinite cell):生长和寿命不受限制的细胞系，能连续传代培养。特点：细胞无限分裂，不具有接触抑制现象，不出现异常染色体 连续细胞系(continuous cell line)永久性细胞系（immortal cell line)异倍体工程细胞系（engineered cell line):采用基因工程技术对宿主细胞的遗传 物质进行修饰，获得具有稳定遗传的独特性状。获得方法：异倍体化，融合或重组转化细胞系：染色体断裂成为异倍体，失去了正常细胞的特点，具有无限增殖 能力。特点：可长期培养，倍增时间短，对培养条件和营养要求较低，适用于 大规模培养 如：Namalwa,CHO,BHK-21,Vero细胞等。,四、动物细胞培养的特性,4.1.细胞生长缓慢，分裂周期1248h，易受微生物污染；4.2.动物细胞较微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；4.3.培养过程需氧量少，且不耐受强力通风与搅拌；4.4.在机体中，细胞相互粘连以集群形式存在，培养过程（电荷作用，钙镁离子作用）具有群体效应，锚地依赖性，接触依赖性及功能全能性；接触抑制（contact inhibition）现象。4.5.培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵；（注：多数分泌胞外，收集纯化方便，得到较完善的翻译后修饰，特别是糖基化，与天然产品一致）4.6.大规模培养时，不可套用微生物反应的经验；,有限细胞系（finite cell line）,五、动物细胞的培养基组成与制备 5.1.培养的环境因素,温度（370.5）oC；渗透压（生理条件下）260320mOsm/Kg 氢离子浓度 7.27.4，接近中性（不能超过6.87.6）其它有机离子 主要代谢物 补充的代谢物 激素 影响细胞代谢的其他因素 细胞生长的基质 各因素间的相互作用,5.2.主要因素：培养基组成和浓度 温度 培养液的酸碱度 溶解氧（O2、CO2）95%空气，5%CO2混合气体，氧的传递非常困 难（40%50%）合适 各种代谢物浓度,5.3培养基组成,5.3.1.AA；5.3.2.维生素类；VB或VB+VC 5.3.3.盐类Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-、HCO3-调节渗透压 酸碱平衡、酶的活性等；5.3.4.葡萄糖能量；5.3.5.缓冲系统磷酸盐 CO2HCO3-；5.3.6.矿物质 来源于血清，无血清时，补充Fe2+、Cu2+、Zn2+、Se2+和其他稀有元素；5.3.7.有机补充物，如核苷类，TCA循环中间产物、丙酮酸盐、类脂等；5.3.8.激素 如胰岛素、生长激素；5.3.9.生长因子类 各来自于血清中，存在的是一些多肽；粘附因子，如纤维结合蛋白、胶原等。关键因素：葡萄糖；谷氨酰胺；能源浓度高 氧气,DMEM培养基（mg/L）L-盐酸Asg42，L-cys24，L-Asn584，L-盐酸His19，L-zle52，L-Leu52，L-盐酸Lys72，L-Met15，L-Phe36，L-Thr48，L-色氨酸8，L-酪氨酸36，L-缬氨酸48，氯化胆碱，叶酸3，肌醇6，烟酸3，泛酸钙3，盐酸吡哆醛3，核黄素0.3，硫胺素3，生物素3，NaCl 6800，KCl 400，CaCl2 200，MgSO47H2O 200，NaH2PO42H2O 150，NaHCO3 2000，Glucose 1000。青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，50mg/mL庆大霉素 10%小牛血清，1%非必需氨基酸,0.1mol/L丙酮酸钠，1%谷氨酸胺,六、动物细胞培养方法与操作方式,6.1 细胞培养方式 6.1.1.体外培养的动物细胞分为两种类型：非贴壁依赖性细胞悬浮培养（anchorage-independent）血液、淋巴组织、肿瘤细胞。6.1.2.贴壁依赖性细胞贴壁培养（anchorage-dependent）大多数动物细胞（吸着于带正电荷的固体或半固体表面上生长）其生长必须有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌或培养基中提供的贴附因子（attachment factor）才能在该表面上生长、繁殖。6.1.3.兼性贴壁细胞：如中国地鼠卵巢细胞。小鼠L929细胞。,贴壁培养 成纤维细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成骨细胞等中胚层细胞。上皮细胞、皮肤细胞等外胚层细胞和内胚层细胞。滚瓶系统培养微载体系统培养法（搅拌罐）（搅拌槽，中空纤维管）粘附比率（玻 璃、纤维素、明胶等增加了比表面积）。接种细胞密度104/cm2(12)105/cm2(劳动密集型),悬浮培养 小规模：转瓶或滚瓶 大规模：细胞反应器（空气提升式、中空纤维管、搅拌槽）与微生物细胞相比较 缺点：细胞密度较低（12)105个/mL(13)106个/mL。(操作简单、易于放大、均匀、易于控制)固定化培养（流化床、固定床）,6.2 细胞培养操作方式,分批式 流加式 半连续式 连续式 灌流式 注意：生物污染（其它动物细胞、微生物、病毒）控制关键：实时检测。,七、动物细胞大规模培养系统,气生式细胞培养系统 微载体培养系统 微束培养系统 大载体系统 中空纤维培养系统 通气搅拌细胞培养系统,抗体（Antibody.Ab）是有抗原刺激机体后，由淋巴B细胞经分化增殖的浆细胞合成的分泌的，能与响应抗原特异结合并具有多方面免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（Immunoglobin,Ig）是只具有抗体活性或其化学结构与抗体相似的球蛋白。Ab与Ig是同义体，已知相应配体的Ig称为抗体。,一、基本概念,第二节 抗体,理化性质及免疫学特性 是机体体液免疫的主要成分,血液中（主要）,环境,其他体液,外分泌液,人的抗体分为五类,IgGIgAIgMIgDIgE,Ig的生化本质：大分子蛋白；具有抗体活性；本身带有多种抗原决定簇，具有一定的 抗原特异性。抗原（Antigen）：诱发机体产生抗体的外来物质。,二、抗体的分类,三、抗体条件：1.只有脊椎动物（鱼类以上）的浆细胞才能产生；2.必须要有抗原物质的刺激；3.能与相应的抗原发生特异性结合；4.其化学本质是一类具有免疫功能的球蛋白。,杂交瘤技术蛋白质工程技术（疾病治疗、诊断）应用广泛 发展前景转基因,三、抗体分子的结构和功能,3.1 抗体分子的结构,两条轻链（light chain,L）两条重链（heavy chain,H）,二硫键连 接,L:210个AA残基，分子量2.3104H:450个AA残基，分子量5.0104,L和H内部具有一系列重复的同源结构单元，每个单元长约110个AA残基。,“Y”字形结构，在“Y”字的的两个支角上，占轻链1/2和占重链的1/4.N端是抗原识别位点。,抗体的结构示意图,抗体的功能区（domain）折叠成球状结构（AA排列顺序因抗体的特异性而异）称可变区（Variable region,简称V区），包括3个互补决定区（VH，VL）（compiementarity-determining region;CDR）羟基-侧，AA排列顺序较恒定恒定区（constant region,c区）H链上有3个C区，CH1，CH2，CH3L链上有1个C区，CL铰链区：H链的中间部分肽段。“Y”“T”互变，不结合抗原，CH2区的补体结合位点被掩盖。,木瓜蛋白酶作用后：Fab片段：抗原结合活性和特异性，一条完整 的L链和H链的VH区以及CH1 Fab片段：两条H链的CH2和CH3区域 Fc片段：无抗原结合活性，但是抗体结合了抗 原以后，激活机体免疫反应的主要部位。,抗体分解的三个部分,主要激活以下免疫反应：(1)激活补偿功能系统。(2)产生抗体依赖性细胞介导毒素。(3)可结合巨噬细胞的Fc受体，使巨噬细胞吞食并毁灭抗原抗体复合体。,根据抗体重链的C区（CH）的不同，将人的重链分为、和五大类。形成的Ig分别称为IgG，IgM，IgE，IgA和IgD。,3.2 抗体的功能,中和毒素 固定微生物生物学功能 中和病毒 凝集抗原颗粒 结合并沉淀可溶性抗原 激活血清补体等。,各类Ig各司其职，共同完成的机体免疫防护任务（1）IgG 最主要的免疫球蛋白，15%，参与几乎所有的体液免疫反应。作用：免疫凝集、免疫沉淀、免疫调理、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、激活补体系统、固定细菌和中和病毒。（2）IgA 机体粘膜局部防御的重要作用因素 功能：杀菌、抗病毒活性和免疫凝集作用（分泌型IgA）。（3）IgM 血液中 功能：补体激活、防止菌血症和败血症。（4）IgE（5）IgD PcAb：亲和力高，制备过程简单，用于诊断试剂，毒蛇咬伤（特殊情况）抗蛇毒抗血清（PcAb）治疗优于McAb。,第三节 单克隆抗体,多克隆抗体（Polycolonal antibody）：同一抗原产生的不同抗体（含有多个抗原决定簇）单克隆抗体McAb（monocolonal antibody）：由单个淋巴细胞针对某一抗原决定簇产生的单个抗体。（B细胞的纯培养）上市药物:Reopro,Herceptin,Campath-1H,Zevalin等,单抗的特点：特异性强 重复性好 操作简便易行（临床诊断快速检测等）医学、临床、药理、食品检测、生化等多个领域。应用：癌症诊断、药物测定、传染病诊断、临床治疗(如蛇毒等）,骨髓瘤细胞 B细胞（myeloma cell）体外生长 无限增殖 杂交瘤细胞 单克隆抗体,B淋巴细胞杂交瘤技术（又称单克隆抗体技术）,德国 Kohler科勒尔 首次利用细胞融合技术制备出单克隆抗体英国 Milstein米尔斯坦 并完善了极微量蛋白质检测技术丹麦 Jerne杰恩 1984年诺贝尔生理学及医学奖,一、杂交瘤细胞的产生,1.杂交瘤细胞系的建立,1.1.免疫B淋巴细胞的制备 B淋巴细胞即期望能分泌特定抗体的细胞。抗原 种类不受限制。纯度要求不高，在筛选时采用均一的所期望的抗原来检测。,1.1.2.免疫（1）动物BALB/C小鼠，BALB/C系列，C57BL/6系列。Lou大鼠 免疫时尽量采用相同的品系动物免疫，与骨髓瘤细胞在种 子 上尽量一致。（2）免疫方法 应考虑抗原的性质、纯度、制剂的选择，因抗原而异。通常方法：体内免疫（皮下、肌内、腹腔免疫，适用于颗粒性抗原）脾内免疫（来源有限，昂贵的抗原免疫，效果不好）体外免疫（分离B淋巴细胞，用于人McAb，效力不高）从脾脏或外周血中。（3）免疫程度：基础免疫一般46周，加强免疫后于融合到34 天，静脉加强。,1.2.骨髓瘤细胞,多发性骨髓瘤细胞：SP2/0Ag14；P3NS1Ag4.1；YB23.0Ag20。要求：(1)自身不合成或至少不分泌任何免疫球蛋白分子或片段。(2)处于良好的生长状态（对数生长期最佳）106个/mL，细胞分裂停止；（1-5）105个/mL浓度最好。,1.3细胞融合,免疫脾细胞悬液 经免疫的BABL/C小鼠，摘除眼球放血，处死，无菌摘除脾脏，研磨，经NH4Cl破碎红细胞后，洗涤调整细胞浓度（1-5）105个/mL骨髓瘤细胞 传代生长24h的细胞数（1-5）105个/mL,融合:B淋巴细胞 瘤细胞 510 1 加入50%PEG（40006000）融合1min 加入无血清培养液 终止融合 洗涤去除PEG 细胞培养液,1.4杂交瘤细胞的筛选,HAT培养液 12周培养 选择出杂交瘤细胞 选择出特异性抗体(ELISA法）1.5杂交瘤细胞的去除 克隆化 96孔板稀释法 软琼脂培养法 选择,1.6单克隆抗体的制备：动物体内法：实验室用（简便、经济），腹水浓度高25mg/ml,比培养法高100010000倍，对一般用途的McAb的首选方法 体外培养法(工业化生产法):体外培养法主要有以下两种：悬浮培养：国际上多用，国内尚空白。固定化培养：贴壁细胞培养，移入载体。注意：与杂交瘤同品系的动物或杂交一代 注意动物的微生物感染 腹水内尚含非特异性抗体，需进行纯化。,1.7单克隆抗体的进一步鉴定：染色体鉴定：小鼠脾细胞染色体40，小鼠骨髓瘤细胞染色体数变异较大，62-69株 特性鉴定：亲和力，酶联免疫吸附测定（ELISA）法 类别鉴定：抗血清/双向免疫扩散法 纯度鉴定：SDS-PAGE电泳法,第四节 抗HBsAg的单克隆抗体生产工艺,抗乙型肝炎表面抗原（HBsAg）单克隆抗体专一性识别HBsAg的单一抗体。临床上用于检测乙型肝炎病毒的感染并用于生产预防乙肝的免疫制剂。生产技术：基因工程、细胞工程,一、工艺流程,二、工艺过程及控制要点,RPMI1640（1）培养基 瘤细胞IR983干细胞系(DMEM)培养基 改良的Dulbeccos Eagle:15种AA,浓度升高1倍，8种维生素,增加3倍。即：（mg/L）:L-盐酸Asg42，L-cys24，L-Asn584，L-盐酸His19，L-zle52，L-Leu52，L-盐酸Lys72，L-Met15，L-Phe36，L-Thr48，L-色氨酸8，L-酪氨酸36，L-缬氨酸48，氯化胆碱，叶酸3，肌醇6，烟酸3，泛酸钙3，盐酸吡哆醛3，核黄素0.3，硫胺素3，生物素3，NaCl 6800，KCl 400，CaCl2 200，MgSO47H2O 200，NaH2PO42H2O 150，NaHCO3 2000，Glucose 1000。青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，50mg/mL庆大霉素 10%小牛血清，1%非必需氨基酸,0.1mol/L丙酮酸钠，1%谷氨酸胺，,改良的Dulbeccos Eagle,杂交瘤细胞筛选：含HAT的DMEM培养基,（2）饲养细胞 大鼠腹腔细胞（同一品系），24孔板：106cell/mL DMEM悬浮液，0.1mL；96孔板：2x 105cell/mL DMEM悬浮液，0.1mL。37oC 5%CO2培养箱温育,（3）亲本细胞准备 取对8-氮鸟嘌呤抗性的Lou/C大鼠非分泌型浆细胞 IR983F细胞（8-Agr）。37oC 1.5105 cell/mL DMEM 对数生长期 CO2培养基中,固定化抗大鼠K轻链的制备 载体：Sepharose 4B,(5)细胞融合,(6)杂交瘤细胞筛选 AUSAB酶免疫法,(7)抗HBsAg的单克隆抗体生产 体外培养法 体内培养法(8)抗HBsAg的单克隆抗体的分离纯化 亲和层析：硫酸铵盐析、离子交换层析或亲和层析等 亲和吸附剂：固定化抗大鼠K轻链的Sepharose 4B 平衡液：pH7.4、0.1moL/L磷酸缓冲液 层次柱：4cm x 20cm;流速：2mL/min；洗涤液：pH7.4、0.1moL/L磷酸缓冲液;洗脱液：pH2.8 甘氨酸-HCl缓冲液；中和液：pH8.0、0.1moL/L Tris-HCl缓冲液，中和至pH7.0 超滤、浓缩、冻干 成品,