《代谢工程》PPT课件.ppt

第三章 微生物的代谢调节和代谢工程,第一节 微生物代谢的自我调节 第二节 代谢调控 第三节 次级代谢产物的主要调控机制 第四节 代谢工程,【教学目的与要求】掌握微生物自身代谢和次级代谢的机理、有关概念及代谢调控，了解代谢工程设计的方向。【教学重点与难点】微生物自身代谢和次级代谢的机理、有关概念及代谢调控。,微生物的生长繁殖和新陈代谢代谢类型：主要依赖两种代谢途径：分解代谢 合成代谢,分解代谢:指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系的催化，产生简单分子、腺苷三磷酸（ATP）形式的能量和还原力（或称还原当量，一般用H来表示）的作用。微生物通过分解代谢从环境中吸收的各种碳源、氮源等物质降解，为生命活动提供能源和小分子中间体。包括：中心途径如TCA、EMP、HMP及外围途径（指碳源、氮源通过分解进入中心途径）,合成代谢与分解代谢正好相反，指在合成代谢酶系的催化下，由简单小分子、ATP形式的能量和H形式的还原力一起合成复杂的大分子的过程。或利用分解代谢的能量和中间体合成氨基酸、核酸等单体物质及蛋白质、多糖等多聚物。分解代谢与合成代谢是互相关联、互相制约，是生命活动的基础。正常微生物的小分子物质的合成和降解是自身调节。,研究微生物代谢调节的意义,十分重要，在工业上可通过对微生物的代谢途径加以控制来满足生产的需要。如：谷氨酸发酵菌种：,微生物的代谢产物可分为：初级代谢产物定义：微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。举例：氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。特征：不同的微生物初级代谢产物基本相同；初级代谢产物合成过程是连续不断的，与菌体的生长呈平行关系。,次级代谢产物定义：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。举例：抗生物、毒素、激素、色素等。特征：不同的微生物次级代谢产物不同；次级代谢产物的通常在菌体的生长后期合成，发酵分两个阶段进行，即营养增殖期和生产期。在多数情况下，增加前体是有效的,两种代谢产物的不同：,1、次级代谢通常在生长后期合成。不是微生物生长所必需的，不参与微生物的生长和繁殖。2、次级代谢对环境条件的变化很敏感，其产物的合成往往会因环境条件的变化而停止。3、不同微生物的次级代谢产物有很大区别。基于菌种的特异性4、催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强。,第一节 微生物代谢的自我调节,微生物有着一整套可塑性极强和极精确的代谢调节系统，以保证上千种酶能正确无误、有条不紊地进行极其复杂的新陈代谢反应。,微生物细胞的代谢调节方式很多，例如可调节营养物质透过细胞膜而进入细胞的能力，通过酶的定位以限制它与相应底物的接近，以及调节代谢流等。其中以调节代谢流的方式最为重要，它包括两个方面，一是“粗调”，即调节酶的合成量，二是“细调”，即调节现成酶分子的催化活力，两者往往密切配合和协调，以达到最佳调节效果。,微生物自我调节部位1养分的吸收和排泄 细胞膜2限制基质与酶的接近3控制通量：调节现有酶量和改变酶分子的活性都涉及到酶促反应的调节包括酶活性的调节和和酶合成的调节,一、酶活性的调节,酶活性的调节：指在酶分子水平上的一种代谢调节，它是通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率。酶活性的抑制 激活 是微生物代谢中存在的两种矛盾的过程。,酶活性的激活系指在分解代谢途径中，后面的反应可被较前面的中间产物所促进。酶活性的抑制主要是反馈抑制，它主要表现在某代谢途径的末端产物（即终产物）过量时，这个产物可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性，促使整个反应过程减慢或停止，从而避免了末端产物的过多累积。,图：大肠杆菌代谢过程的抑制剂和激活剂,（一）酶活性的激活,常见的酶活性的激活是前体激活，多发生在分支代谢途径，即代谢途径中的后面的反应可被较前面的一种代谢中间产物所促进。如：粗糙脉胞酶的异柠檬酸脱氢酶的活性受到柠檬酸的激活。,（二）酶活性的抑制,酶活性的抑制包括：竞争性抑制 反馈抑制 反馈抑制：指反应途径中某些中间产物或末端产物对该途径中前面反应的影响。凡是反映加速地称为正反馈；凡是反应减速的称为负反馈。末端产物的反馈抑制普遍存在于合成途径中。反馈抑制：直链式 分支代谢途径：两种以上的末端产物,反馈抑制的类型,1直线式代谢途径中的反馈抑制,2分支代谢途径中的反馈抑制。反馈抑制的情况较为复杂。为避免在一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供应，微生物已发展出多种调节方式。,（1）同功酶调节 同功酶是指能催化相同的生化反应，但酶蛋白分子结构有差异的一类酶，它们虽同存于一个个体或同一组织中，但在生理、免疫和理化特性上却存在着差别。同功酶的主要功能在于其代谢调节。,在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶所催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。如：大肠杆菌天冬氨族氨基酸合成途径中，有三个同工酶天冬氨酸激酶 分别受赖氨酸、苏氨酸、硫氨酸反馈调节,（2）协同反馈抑制：指分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。如：谷氨酸棒杆菌合成天冬氨族氨基酸时，天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。,（3）累积反馈抑制：催化分支合成途径第一步反应的酶有几种末端产物抑制物，但每一种如过量，按一定百分率单独抑制共同途径中的第一个酶活性，总的抑制效果是累加的，各末端产物所起的抑制作用互不影响，只影响这个酶促反应的速率。两种末端产物同时存在时，可以起着比一种末端产物大得多的反馈抑制作用。,（4）增效反馈抑制：代谢途径中任何一种末端产物过量时，仅部分抑制共同途径中的第一个酶活性，但两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各产物存在的抑制能力的总和。如6-氨基嘌呤核苷酸和6-酮基嘌呤核苷酸合成途径。,（5）顺序反馈抑制：每个分支末端产物抑制分支后的第一个酶，产生部分抑制作用。通过逐步有顺序的方式达到的调节。如枯草芽孢杆菌的芳香族氨基酸合成途径和球型红假单胞菌的苏氨酸合成途径。,当E过多时，可抑制CD，这时由于C的浓度过大而促使反应向F、G方向进行，结果又造成了另一末端产物G浓度的增高。由于G过多就抑制了CF，结果造成C的浓度进一步增高。C过多又对AB间的酶发生抑制，从而达到了反馈抑制的效果。这种通过逐步有顺序的方式达到的调节，称为顺序反馈抑制。,二、酶合成的调节（酶量）,酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节微生物的代谢速率。这是一种在基因水平上（在原核生物中主要在转录水平上）的代谢调节。有诱导调节和阻遏调节。根据酶的生成是否与环境中所存在的该酶底物或其有关物的关系，可把酶划分成组成酶和诱导酶两类。,有些酶的合成不依赖于环境中物质的存在（如糖酵解途径中的各种酶），称为组合酶。另一些酶只有在它们催化的底物（或底物的结构类似物）存在时才能合成，此种酶称为诱导酶。凡能促进酶生物合成的现象，称为诱导。能阻碍酶生物合成的现象，则称为阻遏。,与上述调节酶活性的反馈抑制等相比，调节酶的合成（即产酶量）而实现代谢调节的方式是一类较间接而缓慢的调节方式。其优点则是通过阻止酶的过量合成，有利于节约生物合成的原料和能量。在正常代谢途径中，酶活性调节和酶合成调节两者是同时存在且密切配合、协调进行的。,（一）酶合成调节的类型,1诱导诱导酶：另一些酶只有在它们催化的底物（或底物的结构类似物）存在时才能合成，此种酶称为诱导酶。诱导酶是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。,能促进诱导酶产生的物质称为诱导物，它可以是该酶的底物，也可以是难以代谢的底物类似物或是底物的前体物质。外源诱导物：外源加入的。内源诱导物：菌体代谢途径的某些中间产物也能诱导该途径的某些酶系的合成，这些中间产物称为内源诱导物。,酶的诱导合成类型,同时诱导:当诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成，它主要存在于短的代谢途径中。例如，将乳糖加入到Ecoli培养基中后，即可同时诱导出-半乳糖苷透性酶、-半乳糖苷酶和半乳糖苷转乙酰酶的合成；顺序诱导:先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。,2阻遏 在微生物的代谢过程中，当代谢途径中某末端产物过量时，除用反馈抑制的方式来抑制该途径中关键酶的活性以减少末端产物的生成外，通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。,反馈阻遏：指代谢的终产物达到一定浓度时，反馈阻遏该代谢途径的一种或几种酶的生物合成。阻遏作用有利于生物体节省有限的养料和能量。阻遏的类型主要有两种:末端代谢产物阻遏 分解代谢产物阻遏。,（1）末端产物阻遏,定义：指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏。对直线式反应途径，末端产物阻遏的情况较为简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使之合成受阻遏。,对分支代谢途径来说，情况就较复杂。每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。多价阻遏：有两种或两种以上的末端产物的分支代谢途径中，当分支代谢途径中的几种末端产物同时过量就反馈阻遏其分支点以前的共同途径的“公共酶”的合成，仅一种产物过量无阻遏作用。末端产物阻遏在代谢调节中有着重要的作用，它可保证细胞内各种物质维持适当的浓度。,（2）分解代谢产物阻遏,定义：指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）或其分解产物存在时，被菌体迅速利用的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的碳源本身直接作用的结果，而是通过碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。因此，分解代谢物的阻遏作用，就是指代谢反应链中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢途径中一些酶合成的现象。,两种调节的对比,三、能荷的调节,能荷指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可供利用的高能磷酸键的量度。能荷调节（或称腺苷酸调节）：指细胞通过改变ATP、ADP、AMP三者的比例来调节其代谢活动。细胞内3种腺苷酸含量不同，细胞的能荷状态不同。能荷状态用“能荷”表示,当细胞内全部为ATP，能荷为100%当细胞内全部为ADP，能荷为50%ATP可以认为是糖分解代谢的末端产物，当ATP过量就对糖分解代谢产生反馈抑制，当ATP降解为ADP，能量释放于其他的生化反应，反馈抑制被解除。,R曲线合成系统，如磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶等。U曲线消耗ATP的酶系，柠檬酸裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP)等。当能荷0.75，合成受到抑制，酶活性急速下降，消耗ATP的酶活性急速上升。两系统在0.85处交叉，酶系达到平衡。这种现象存在于许多生长状态的细胞中。细胞通过调节腺苷酸的比例，来协调分解代谢与合成代谢的代谢速率。,第二节 代谢调控,微生物在正常生长条件下，可以通过自我调节使机体内的代谢途径与代谢类型互相协调与平衡，通常不会过量积累初级代谢产物。在某种条件下，过量积累的中间代谢产物也能够被诱导酶转化为次级代谢产物。但在人为条件的控制下，可以使微生物过量产生各种初级代谢产物和次级代谢产物。初级代谢产物控制比较简单。它的形成一般只需要营养条件即可生成。通过改变发酵工艺条件如pH、温度、培养基组成和微生物遗传特性等，达到改变菌体内的代谢平衡，过量产生所需要产物的目的。,可通过发酵条件控制改变细胞的渗透性 改变菌种的遗传特性,一、发酵条件的控制,1 各种发酵条件对微生物代谢的影响同一种微生物在同样的培养基中进行培养时，只要控制不同的发酵条件。就可能获得不同的代谢产物。如：啤酒酵母在中性和酸性条件下培养，可将葡萄糖氧化生成乙醇和二氧化碳；当在培养基中加入亚硫酸氢钠或在碱性条件下培养时，则并不产生乙醇，而是产生甘油。,控制不同的发酵条件，实际上是影响微生物自身的代谢调节系统，而改变其代谢方向，使之按人们所需要的方向进行，进而达到获得高浓度积累所需要产物的目标。,2 使用诱导物许多与蛋白质、糖类或其他物质降解有关的酶类都是诱导酶，在发酵过程中加入相应的底物作为诱导物，可以有效地增加这些酶的产量。如：在木霉发酵生产纤维素酶中，加入槐糖可以诱导纤维素酶的产生；木糖可以诱导半纤维素酶的生成。青霉素酰化酶可用苯乙酸为诱导物。乙内酰胺酶发酵时，可以底物类似物为诱导物增加酶的产量。,3 添加生物合成的前体,仅参与色氨酸的最后阶段的合成，如果在发酵中加入邻氨基苯甲酸，虽然色氨酸对第一个酶的反馈抑制仍然存在，但对由邻氨基苯甲酸合成色氨酸并无影响，使色氨酸的合成可以不断进行，从而大幅度提高了发酵产量。,色氨酸生物合成途径,4 培养基成分和浓度的控制,培养基即要保证微生物机体生长需要，又要利于代谢产物的合成，须考虑其的组成和浓度，尽量避免培养基使用不当引起的分解代谢阻遏。在发酵培养基中通常采用适量的速效和迟效碳源、氮源的配比，来满足机体生长的需要和避免速效碳、氮源可能引起的分解代谢阻遏。例如，用甘油代替果糖作为碳源培养嗜热脂肪酵母，可以使淀粉酶的产量提高25倍以上；用甘露糖代替乳糖作为培养荧光假单胞菌的碳源，使纤维素酶产量提高1500倍以上。,改变细胞透性,在发酵过程中，可以控制使用那些影响细胞膜通透性的物质作为培养基的成分，有利于代谢产物分泌出来，避免了末端产物的反馈调节。例如，利用棒状杆菌的-酮戊二酸脱氢酶缺失突变株，在葡萄糖培养基中发酵生产谷氨酸，当谷氨酸浓度达到50mg/g(干细胞)时，由于反馈调节作用，谷氨酸的合成便终止。若将细胞中的谷氨酸释放出细胞，而使胞内谷氨酸浓度降低，就可以解除反馈抑制，使谷氨酸继续合成。,改变细胞的通透性的方法：,1、限制培养基中生物素浓度在15mg/L，控制细胞膜中脂质的合成；2、加入青霉素，抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链的交联；3、还可加入表面活性剂如吐温80或阳离子表面活性剂，将脂类从细胞壁中溶解出来，使细胞壁疏松，通透性增加；4、控制Mn2+、Zn2+的浓度，干扰细胞膜或细胞壁的形成。另外，还可以通过诱变育种的方法，筛选细胞透性突变株。,同样增加细胞壁或细胞膜的通透性，对某些胞外酶的分泌也有一定作用。如在里氏木霉发酵过程中加入吐温80，可提高纤维素酶的产量。,改变菌种的遗传特性,反馈调节是微生物防止合成代谢产物过量产生的重要机制，解除反馈调节作用可以保证高水平积累各种代谢产物，除上所述外，改变微生物的遗传特性，即改变酶的活性或酶的合成系统，使之对反馈调节不敏感，也能够达到过量生产代谢产物的目的。,筛选抗反馈调节突变株：通过诱变育种的方法获得。包括营养缺陷型突变株、抗反馈调节突变株、组成型突变株、抗性突变株等的应用。例如，在分支合成途径中，利用黄色短杆菌抗-氨基-羟戊酸(苏氨酸的一种结构类似物)的突变株发酵生产苏氨酸，由于该菌株的同型丝氨酸脱氢酶对苏氨酸的反馈抑制不敏感，可以使发酵液中苏氨酸的浓度高达14g/L。,在分支合成途径中可以利用营养缺陷型突变株生产其中的一个末端产物。选择高丝氨酸脱氢酶营养缺陷型。大量生产赖氨酸。,在直链式合成途径中，不能利用营养缺陷型突变株生产该途径中的末端产物，但可以利用这种菌株生产中间产物。例如，利用谷氨酸棒状杆菌营养缺陷型(转氨甲酰酶缺陷)可以大量积累鸟氨酸。分支合成途径中，也可以利用双重营养缺陷型生产某种代谢产物。例如利用谷氨酸棒状杆菌的苏氨酸、甲硫氨酸双重营养缺陷型进行发酵，可以过量合成赖氨酸，赖氨酸浓度可达50g/L。,A B C D E,除了利用抗反馈调节突变株和营养缺陷型菌株生产外，还可以利用既是抗反馈调节突变株，又是营养缺陷型菌株的双重突变株进行氨基酸发酵。例如，利用甲硫氨酸营养缺陷型和抗-氨基-羟戊酸的黄色短杆菌过量合成苏氨酸；利用酪氨酸营养缺陷型和抗对氨基苯丙氨酸的谷氨酸棒杆菌高水平积累苯丙氨酸。,人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸？,营养缺陷,第三节次级代谢产物的主要调控机制,次级代谢是存在于某些生物如植物和某些微生物中一类特殊的代谢类型，次级代谢产物与人类的生活和健康长寿有着密切的关系，因此对其的研究受到了广泛地重视。研究最多、最著名的是抗生素，其他包括生长刺激素、生物碱、维生素、色素、毒素等。,一、次级代谢的调节类型,因为次级代谢产物的种类在不同的微生物中非常不同，所以次级代谢途径远比初级代谢复杂，其代谢调节类型的多样亦可想而知。已知抗生素等次级代谢产物生物合成的调控类型包括诱导调节、碳分解产物调节、氮分解产物调节、磷酸盐调节、反馈调节、生长速度调节等。,酶合成的诱导调节,在次级代谢途径中，某些酶也是诱导酶，在底物或底物的结构类似物存在时才会产生。例如，卡那霉素-乙酰转移酶是在6-氨基葡萄糖-2-脱氧链霉胺（底物）的诱导下才能合成。参与展开青霉的棒曲霉素合成的酶是被生物合成中的中间产物6-氨基水杨酸、龙胆酰醇和龙胆酰醛顺序诱导合成。,反馈调节,反馈调节在次级代谢产物的生物合成中有着重要的作用，包括次级代谢产物的自身反馈调节、分解代谢产物调节、初级代谢产物的反馈调节。,1、次级代谢产物的自身反馈抑制和反馈阻遏,在多种次级代谢产物的发酵中，如青霉素、链霉素、卡那霉素、氯霉素、嘌呤霉素、霉酚酸、杀真菌素、麦角碱等的生物合成途径中，都发现了末端产物的反馈调节作用。,例如：嘌呤霉素合成途径中，嘌呤霉素可以反馈抑制其生物合成途径中催化最后一步反应的酶甲基转移酶的活性；卡那霉素合成途径中，卡那霉素能够反馈抑制其合成途径中催化最后一步反应的酶N-乙酰卡那霉素转移酶的活性；麦角碱合成途径中，麦角碱能抑制合成途径中的二甲基丙烯色氨酸合成酶和裸麦素碱环化酶的活性；氯霉素合成途径中，氯霉素能反馈阻遏其合成途径中第一个酶芳香胺合成酶的活性，但不影响产生菌体内其他芳香化酶的活性。,抗生素生产菌的生产能力与自身抑制所需抗生素浓度呈正相关性，生产能力越高的菌株，反馈抑制所需抗生素浓度也越高。如产黄青霉Q176的生产能力为420g/ml，受到抑制的浓度为2mg/ml；产黄青霉菌株RL1951的生产能力为125g/ml，受到抑制的浓度为200g/ml。,2分解代谢产物调节,定义：指易被菌体迅速利用的碳源和氮源及其分解产物对其他代谢途径的酶类的调节作用。,在许多抗生素发酵中，都发现了葡萄糖的抑制作用，如青霉素、盐霉素、春日霉素、吲哚霉素、放线菌素、卡那霉素、新霉素、杆菌肽等。次级代谢产物的生物合成，一般是在葡萄糖等速效碳源耗至一定浓度才开始。除了葡萄糖外，凡能促进产生菌生长速度的碳源，对次级代谢产物生物合成都表现出抑制作用。次级代谢产物的合成速率与产生菌的生长速率呈相反关系。例如，在放线菌素生物合成中的氧化酚嗯嗪合成酶，受葡萄糖的阻遏。短杆菌肽合成中，葡萄糖分解生成的乙酸和丙酸，在低pH条件下对短杆菌肽的合成产生阻遏作用。,氮分解代谢产物调节也存在于次级代谢中。例如，以铵盐作为链霉素产生菌的唯一氮源时，可以抑制链霉素的合成；在利用烟曲霉生产三羟甲苯中，无机氮源有利于菌体生长，但不利于三羟甲苯的合成；氮分解代谢产物的阻遏作用也存在于头孢霉素生物合成中。,3初级代谢产物的调节,某些初级代谢产物可以调节次级代谢产物的合成，有两种情况：1初级代谢产物和次级代谢产物的合成有一条共同的合成途径，当初级代谢产物积累时，反馈抑制了某一步反应的进行，而最终抑制了次级代谢产物的合成。2初级代谢产物直接参与次级代谢产物的生物合成，即初级代谢产物是次级代谢产物的生物合成的前体，当此种初级代谢产物因为积累，反馈抑制了它自身的合成时，必然也同时影响了次级代谢产物的合成。,如：青霉素合成中，赖氨酸的过量抑制了同型(高异)柠檬酸的合成，进而抑制了-氨基己二酸的形成，这样即抑制了赖氨酸的合成，也抑制了青霉素的合成，因为赖氨酸与青霉素的合成有一段共同的合成途径,(三)磷酸盐的调节,在抗生素等多种次级代谢产物合成中，高浓度磷酸盐表现出较强的抑制作用，称为磷酸盐调节。磷是微生物生长繁殖的必需元素，浓度为0.3300mmol/L时，能支持微生物细胞的生长，但当浓度超过10mmol/L时，就能抑制许多抗生素的生物合成。因此，磷酸盐是一些次级代谢的限制因素。,微生物合成的次级代谢产物途径的不同，磷酸盐表现的调节机制也不同。,1、磷酸盐能促进初级代谢，抑制菌体的次级代谢,在微生物的代谢中，磷酸盐除影响糖代谢、细胞呼吸及细胞内ATP水平外，还控制着产生菌的DNA、RNA、蛋白质和次级代谢产物的合成。如：向正在合成杀假丝菌素的灰色链霉菌培养液中添加5mmol的磷酸盐，产生菌对氧的需要量显著增加，抗生素的合成立即停止，同时细胞内的RNA、DNA和蛋白质的合成速率恢复到菌体生长时期的速率。当磷酸盐被耗尽时，菌体的呼吸强度，DNA、RNA和蛋白质的合成速率又降至抗生素合成期的状态，抗生素重新开始合成。,2过量磷酸盐抑制次级代谢产物前体的生物合成,在链霉素合成中，肌醇是合成链霉胍的前体(链霉胍是组成链霉素的亚单位)，是由葡萄糖衍生来的。过量的磷酸盐能引起菌体内焦磷酸浓度增高，焦磷酸是催化6-磷酸葡萄糖向1-磷酸肌醇转化的6-磷酸葡萄糖环化醛缩酶的竞争性抑制剂。因此，培养液中磷酸盐浓度高时就抑制肌醇的形成，则必然影响链霉素产量。,3磷酸盐阻抑次级代谢中的磷酸酯酶,在链霉素等的生物合成途径的最后一个中间体，是无生物活性的磷酸化产物链霉素磷酸酯。此酯在磷酸酯酶的作用下生成相应的链霉素和磷酸。另外在链霉素生物合成中有三步是在磷酸酯酶作用下的去磷酸反应。上述的磷酸酯酶受到无机磷酸盐的调节。所以在链霉素等氨基糖苷类抗生素的发酵生产时，要很好控制发酵培养基中的磷酸盐浓度。,(四)ATP的调节作用,在研究四环素的生物合成过程中发现，产生菌体内的ATP水平调节着四环素的合成。,丙二酰CoA是四环素合成的前体。在菌体生长旺盛期，乙酰CoA羧化酶活性高，而磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和羧基转移酶的活力很低，在四环素合成期与其相反。,菌体生长时期，过量的无机磷和ATP对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶抑制作用沿左侧途径进行，合成时期沿绿色途径进行。,(五)产生菌生长速率的调节,在丰富培养基中进行的分批发酵动力学研究表明，大多数发酵过程都分为生长期和生产期。在生长期次级代谢产物合成酶受到阻抑作用，次级代谢产物不被合成。主要是一些抗生素合成酶受到抑制或阻遏。,用恒化器培养法研究短杆菌肽S合成酶的合成时发现，调节短杆菌肽S合成酶合成的是菌体的生长速率。当稀释率高时(0.450.5/h)，合成的酶量很少，降低稀释率，酶量就增加。限制不同营养成分，出现最高酶活的稀释率是不同的。限碳源时，酶的比活最高。由此提出调节次级代谢产物生物合成的因子是菌体的比生长速率，而不是某种营养物质，在青霉素、四环素等的发酵生产过程中，控制菌体的比生长速率，能提高发酵水平，可能与调节菌体比生长速率有关。,次级代谢调节：1酶合成的诱导调节2反馈调节：次级代谢产物自身，分解代谢产物的调节 初级代谢产物的调节3磷酸盐的调节：促进初级代谢，抑制次级代谢；过量抑制次级代谢的前体；阻抑次级代谢的磷酸酯酶。4ATP调节5产生菌生长速率的调节,第四节 代谢工程,代谢工程系指利用基因工程技术，定向地对细胞代谢途径进行修饰、改造，以改变微生物的代谢特性，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，构建新的代谢途径，生产新的代谢产物的工程技术领域。在代谢工程设计中，主要有改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种.,一、改变代谢途径,改变代谢途径是指改变分支代谢途径的流向，阻断其他代谢产物的合成，以达到提高目标产物的目的。改变代谢途径有各种方法，如加速限速反应、改变分支代谢途径流向、构建代谢旁路、改变能量代谢途径等不同方法,1 加速限速反应,最成功的一个例子是头孢霉素C的代谢工程菌的构建，头孢霉素C的合成途径。青霉素N是头孢霉素合成的中间体。当用顶头孢发酵时，发现了青霉素N的积累，这表明下一步酶反应是头孢霉素合成代谢中的限速步骤。因此克隆了编码脱乙酰氧基头孢霉素C合成酶基因cefEF，并导入顶头孢中，所得转化子的头孢霉素C产量提高了25，而青霉素N的积累量减少至原来的1/16。,头孢霉素C的代谢工程菌的构建,克隆了编码脱乙酰氧基头孢霉素C合成酶基因cefEF,限速步骤,所得转化子头孢霉素C产量提高了25，而青霉素N的积累量减少至原来的1/16。,2、改变分支代谢途径流向,是指提高代谢分支点的某一代谢途径酶系的活性，在与另外的分支代谢途径的竞争中占据优势，亦可提高目的末端代谢产物的的产量。,如：赖氨酸合成，选育解除反馈抑制和缺失高丝氨酸脱氢酶的突变株，提高了赖氨酸的产量。而为了获得苏氨酸的高产菌株，以解除了反馈抑制的赖氨酸产生菌棒状杆菌为宿主，转入高丝氨酸脱氢酶基因，结果使原来不产生苏氨酸的赖氨酸产生菌的赖氨酸产量由65g/L下降至4g/L，而苏氨酸产量增加到52g/L，使赖氨酸产生菌转变成苏氨酸产生菌。,高丝氨酸脱氢酶基因,赖氨酸产生菌棒状杆菌,产生菌的赖氨酸产量由65g/L下降至4g/L，苏氨酸产量增加到52g/L，赖氨酸产生菌转变成苏氨酸产生菌。,3、构建旁路代谢4、改变能量代谢途径,二、扩展代谢途径,定义：指在引入外援基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端产物。或使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料合成代谢产物。,三、转移或构建新的代谢途径,指将催化一系列反应的多个酶基因，克隆到不能产生某种新的化学结构的代谢产物的微生物中，使之获得产生新的化合物的能力；或利用基因工程手段，克隆少数基因，使细胞原有无关的两条代谢途径联结起来，形成新的途径，产生新的代谢产物；或将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一位生物中，使之发生代谢转移，产生目的产物。,代谢工程实际上是基于基因工程的基础上，目前大多数还处于试验室研究阶段，研究前景十分广阔，希望这方面的研究成果，能为发酵工业带来实际的经济效益。,思考题：,1、概念：分解代谢、合成代谢、能荷、反馈抑制、反馈阻遏、协同反馈抑制、累积反馈抑制、增效反馈抑制、顺序反馈抑制2、什么是初级代谢产物、次级代谢产物？两者的异同？3、微生物自我调节的方式有那几种？4、详细论述分支途径的反馈抑制类型？5、详述微生物自身调节的酶合成调节？,6、详细论述如何通过代谢调控实现对初级代谢产物的大量积累？7、改变细胞通透性的方法？8、次级代谢的调节机制？9、磷酸盐的调节机制？10、代谢工程设计中，改变代谢途径的方法？,