《RNA的结构》PPT课件.ppt

1,第四章 RNA的结构,2,分子生物学的中心法则（central dogma）,1957年由Crick提出,3,中心法则的补充和发展,1970年，巴尔的摩（DBaltimore）和梯明（HMTemin）在致癌的RNA病毒中，发现一种酶，能以RNA为模板合成DNA。他们称这种酶为依赖RNA的DNA多聚酶，现在一般称为逆转录酶。这就是说，遗传信息流也可以反过来，从RNADNA。这是一项重要的发现。巴尔的摩和梯明于1975年荣获诺贝尔奖。,4,1981年，切赫（TRCech）等人在四膜虫发现自催化剪切的tRNA。1983年阿尔特曼（SAltman）领导的一个研究小组发现大肠杆菌的核糖核酸P的催化活性取决于RNA而不是蛋白质。这意味着RNA可以不通过蛋白质而直接表现出本身的某种遗传信息，而这种信息并不以核苷酸三联体来编码。这是对中心法则的又一次补充和发展。切赫和阿尔特曼荣获1989年的诺贝尔化学奖。,5,1994年，乔依斯（GFJoyce）等人发现一个人工合成的DNA分子具有一种特殊的磷酸二酯酶活性。此后，国外又有多例报道人工合成的DNA序列具有各种不同的酶活性。1995年，我国学者王身立等人发现，从多种生物中提取的DNA均具有酯酶活性，能催化乙酸萘酯水解为萘酚和乙酸。这种较弱的酯酶活性并不需要特定序列的DNA编码，而是非特异性DNA的一般性质。王身立推测，在生命起源时，RNA和蛋白质都还未出现，原始海洋营养汤中的DNA可能利用本身的酯酶活性水解萘酯等物质以获得能量。随着生命的进化，酶活性更强的蛋白质出现了，在生命世界中DNA作为酶的作用则为蛋白质所取代。但DNA分子本身的酯酶活性仍作为一种“分子化石”的遗迹，一直保存到今天。,6,第一节 RNA和DNA的结构差异,7,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,8,当核苷酸寡聚形成RNA时，2位的羟基是游离的，这个游离的羟基使得RNA的化学性质不如DNA稳定，也使得RNA较DNA能产生更多的修饰组分RNA除了生成3,5-磷酸二酯键外还可以跟核苷酸生成2,5-磷酸二酯键,9,在RNA中为尿嘧啶残基。尿嘧啶与胸腺嘧啶的区别仅仅在于嘧啶环的C5位上，后者相当于前者的甲基取代衍生物，由于甲基基团的引入，通过空间效应和电子效应产生一定的影响，致使U有别于T,尿嘧啶uracil 胸腺嘧啶thymine,10,从氢键的相互作用看，尿嘧啶和胸腺嘧啶具有相同的参与碱基配对的氢键作用位点，且尿嘧啶除了跟A配对外，还可以跟G配对，这对于RNA链形成稳定的特征性自身折叠结构起着一定的作用。U和T在N1,C2,N3,C4,C5,C6,O2,和O6位置上有着几乎相同的原子静电荷,11,第二节 RNA的结构特征,RNA最重要的结构特征是其单链结构和因单链回折而形成的特征性结构。这些结构对于RNA执行多种生物学功能是至关重要的。我们对于RNA的结构，特别是mRNA和rRNA的三维结构缺乏了解，因而也在客观上影响了对RNA的研究,12,RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。RNA为单链分子。少数RNA病毒RNA为双链分子。主要存在于细胞核、细胞质。,13,根据RNA的功能，可以分为 mRNA、tRNA、rRNA、hnRNA、snRNA、SnoRNA。它们在遗传信息的传递、表达和调控过程中承担着不同的角色，执行不同的功能。,14,（1）、mRNA(信使RNA),约占总RNA的3-5%。不同细胞的mRNA的链长和分子量差异很大。它的功能是将DNA的遗传信息传递到蛋白质合成基地 核糖核蛋白体。,Messenger RNA,15,（2）tRNA(转移RNA),约占总RNA的10-15%。它在蛋白质生物合成中起翻译氨基酸信息，并将相应的氨基酸转运到核糖核蛋白体的作用。已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRNA。RNA分子的大小很相似，链长一般在73-78个核苷酸之间。,Transfer RNA,16,（3）rRNA(核糖体RNA),约占全部RNA的80%，是核糖核蛋白体的主要组成部分。rRNA 的功能与蛋白质生物合成相关。,Ribosome RNA,17,随着具有酶功能的RNA（核酶）、反义RNA的发现以及对核不均一RNA（heteronuclear RNA，hnRNA）和核小分子RNA（small nuclear RNA，snRNA）等的研究深入，一幅绚丽多姿、和谐美妙的RNA多样性图像展现在我们面前。复杂性？从分析和综合的角度，沿着遗传信息传递的途径，从转录和反转录两方面来揭示为何一个双螺旋DNA分子经过转录会产生如此多种多样的RNA分子，以及这些RNA分子在调控条件下又是如何协调作用，并反转录为DNA分子的。,18,20世纪90年代以来，一系列新的核仁小分子RNA（small nucleolus RNA,SnoRNA）的发现及其在核糖体生物合成中调控作用的确定，在RNA分子生物学领域刮起了“核仁风暴”。通过对SnoRNA结构与功能的研究，使真核生物rRNA加工中的一系列重大难题（加工体系的构成、修饰核苷生成原理、正确的分子折叠及构型转变等）取得了突破，揭示了真核生物核糖体生物合成过程中复杂的基因表达体系与调控机制。,19,20,RNA的多样性包括结构的多样性和功能的多样性。相对于RNA的一维线性结构的多样性而言，其单链自身回折形成的特征性二级结构和高级结构的多样性更具吸引力和富于挑战性。,21,值得注意的是：,跟蛋白质和其他分子结合的位点或功能性位点，大多位于茎环结构的环区或游离的端区。在tRNA二级结构中，几乎所有恒定的和半恒定的核苷酸都处在非氢键互补区。rRNA和mRNA的二级结构在不同程度上也具有类似的情况。5SrRNA与tRNA打结形成分子间螺旋，对于tRNA上的TCG臂的几何构象。,22,第三节 RNA的一级结构,1.RNA一级结构的测定片段重叠法直读法,23,RNA的测序,一般过程：目的RNA的分离提纯3,5末端分析目的RNA降解为2套小片段，并分离各片段片段测序拼凑 RNA的水解碱水解：高温稀氨水可以将RNA彻底水解，水解位置在 NpNp，产物为3-NMP。,24,酶水解：,25,RNA的末端分析5末端分析：先用PMase去掉RNA端点核苷酸的游离磷酸根，露出-OH，再用多核苷酸激酶和放射性同位素P32（简记为-P32）标记过的ATP，将RNA5末端核苷酸的5位上接上-P32，这样就把5端核苷酸标记了。稀氨水彻底水解RNA，电泳，放射自显影，标准图谱对照，可知该核苷酸的种类。3末端分析：操作同上，在电泳图谱上找出核苷的位置。对照标准图谱，可知该核苷酸的种类。,26,RNA片段测序：将这个RNA片段的5端进行标记（P32）4种RNA内切酶进行不同步的作用（解释:每个分子的作用位点都不同），电泳分离各产物，放射自显影，直读核酸序列。例如：*AGCUAGCU 5RNase CMCT+RNase RNase T1 RNase U2 直读5-1*A A 2*AG*AG G 3*AGC*AGC C 4*AGCU U 5*AGCUA A 6*AGCUAG*AGCUAG G 7*AGCUAGC*AGCUAGC C 8*AGCUAGCU U,27,RNA的基本组成单位是腺嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、胞嘧啶和尿嘧啶核苷酸4种基本核苷酸和少量的稀有核苷酸。不同种类的每分子RNA所含的核苷酸总数是不同的，少的仅含有几十个核苷酸，多的则含几百或几千个核苷酸。其中，每种核苷酸的含量在同一个RNA分子中也是不同的，核苷酸的排列顺序也不一样。,28,不同的RNA分子核苷酸总数、每种核苷酸的含量和核苷酸的排列顺序均不相同，但是各个核苷酸之间的连接方式完全相同，都是由前一个核苷酸的C3羟基与后一个核苷酸的C5羟基通过生成磷酸二酯键（即3,5磷酸二酯键）而彼此相连形成一条多核苷酸链。在通常情况下，RNA多核苷酸链不含侧链，但是在mRNA的剪接加工过程中形成套索中间产物时，会因生成2,5磷酸二酯键而出现分支结构，且RNA分子往往由单股多核苷酸链构成。,29,2.各类RNA一级结构特点的比较,mRNAtRNArRNA mRNA代谢较快（有的mRNA仅存在1min），与mRNA相比，tRNA和rRNA要稳定的多。,30,RNA核苷酸链的长短和序列,tRNA分子的一级结构分析表明，其分子链都很短，在长度上接近，最短的是73个核苷酸，最长的是94个核苷酸，它们的3末端都是CpCpA-OH序列，这一序列是tRNA结合和转运氨基酸时必不可少的。研究发现，同功tRNA的核苷酸序列非常近似，而非同功tRNA则相差较大。,31,rRNA分子的链长相差较大 来源于各种原核和真核细胞的所有5SrRNA的链长大多在116121个核苷酸之间 来源于真核细胞的5.8SrRNA都是由130160个核苷酸组成的短链。大肠杆菌的16SrRNA的链长为1542个核苷酸，23SrRNA的链长是2904个核苷酸 真核细胞中的十几种snRNA，最小的链长是70个核苷酸，最大的为300个核苷酸，且它们的一级结构大多数已被测定。,32,通常各种mRNA分子的链长都大于前两者。但是各种mRNA分子的链长并不相同，一般为几百，几千，少数甚至为上万个核苷酸长链。,33,RNA链的修饰度,在各种RNA链中，除4种基本核苷酸外，还含有多种稀有核苷酸。tRNA中的含量最高，约占其总核苷酸数的520rRNA次之，含量约为0.61.7mRNA中最少或者不含稀有核苷酸,34,真核细胞tRNA中，稀有核苷酸含量在各类RNA中最为丰富。例如酵母丙氨酸tRNA，在其76个核苷酸构成的链中，有10个是稀有核苷酸；由85个核苷酸构成的的酵母丝氨酸tRNA链中，就有17个稀有核苷酸。就目前所掌握的资料看，所有tRNA的反密码子3端相邻位置上的核苷酸都是嘌呤核苷酸，且绝大多数情况下是单纯甲基化的稀有核苷酸，如m1G，m6G，m2A，m1I，或其他修饰稀有核苷酸，如i6A，mS2i6A，t6A，m6t6A，Y，Yt等。,35,实验证明，在tRNA这个位置上的核苷酸的修饰度越高，则该tRNA与mRNA以及核蛋白体的结合能力越大促进蛋白质生物合成的效率也越高。在tRNA反密码子中，第一个核苷酸往往是稀有核苷酸，其中以次黄苷酸最多，其次是m2A，m5C，ac4C，Gm，Cm，m5S2U以及其他一些修饰度更高的稀有核苷酸。真核细胞tRNA链中稀有核苷酸的含量不仅高于原核细胞tRNA链中稀有核苷酸的数量，而且所含种类及分布情况也不一样，这可能与生物的进化有关。,36,就rRNA的修饰度而言，原核细胞rRNA分子链的修饰度远远低于真核细胞的rRNA链的修饰度。在原核细胞mRNA分子中不含稀有核苷酸，即这类mRNA分子链似乎完全不被修饰；在真核细胞mRNA分子中仅含有极少量的稀有核苷酸，主要是m7G和Nm类，而且都集中在mRNA的5端非翻译区。此外，2个非翻译区的中部还往往各含有一个m6A,37,原核及真核细胞mRNA一级结构的特征及其功能的关系,差别很大：原核多顺反子真核单顺反子,38,绝大多数原核细胞的mRNA都是多顺反子（polycistron）型的信使，即一个原核mRNA分子带有指导合成几种蛋白质的遗传信息，也就是可以作为合成几种蛋白质的模板（template）。他们都是能为几种蛋白质编码的操纵子（operon）的转录产物或是自身复制品。例子 乳糖操纵子（lac）,39,40,调节蛋白与乳糖操纵子的结合模型,41,所有已知真核细胞中的mRNA都是“单顺反子”（monocistron）型的信使，即一个真核mRNA分子只带有指导合成一种蛋白质的遗传信息，也就是只能作为合成一种蛋白质的模板。真核细胞mRNA是由前体（核不均一RNA）经剪接加工后转变而来；原核细胞的mRNA则是边转录边翻译。,42,迄今为止了解的较为清楚的多顺反子型mRNA是一些噬菌体的RNA。它们既是复制自己的基因又是合成其所含蛋白质的模板。,43,44,3.RNA一级结构与分子进化（molecular evolution）,分子进化以生物大分子一维线性结构为主要对象，已经发展成为当今生物进化研究的一个十分活跃的领域。有待解决的问题如下：生物大分子的一级结构与分子进化 通常认为，生物大分子的一级结构决定其高级结构。从迄今为止的研究来看，通过生物大分子一级结构的比较和分析，进而研究不同种属生物体中同源生物大分子的差异程度，确实是推动分子进化研究的一个重要方向。但是不能因此认为，根据生物大分子一级结构的比较分析，就可以描绘出物种进化的系统发生树（phylogenetic tree），并可以对不同种属间的亲缘关系给出一个定量的概念。因为这里忽略了层次结构间的差别，又忽略了系统与子系统间的差别,45,生物大分子的高级结构与分子进化 目前主要根据同源生物大分子在三维结构上的差异来确定亲缘关系，并且已经取得了一些有意义的结果 必须把不同种属生物体的同源生物大分子的亲缘关系与不同种属生物体间的亲缘关系区分开来 由于生物大分子在生物系统中的功能主要是在其三维结构上体现的，因此对生物大分子三维结构的详细了解是揭示同源分子进化关系的重要因素。,46,生物进化过程中，生物系统实现着最巧妙、最复杂的控制和信息过程 生物的进化和分子水平上的变异也是一个统一的控制过程。就一个核酸序列而言，它在进化中形成并固定下来，实际上是一个非常复杂的历史过程，其中包括着各种功能的制约。因此尽管每一个基因序列是稳定的，但它仍然受着大量的历史中出现的许多因素的支配，因而需要用控制和系统的理论，运用非平衡统计（nonequibrium statistic）的方法才有可能从大量序列资料的分析中导出其必然的内在的规律性。,47,生物进化研究中的非线性问题（nonlinear problems）鉴于生物系统是非线性的系统，因而在生物进化的研究中如何处理非线性的问题，也就成了未来生物学的研究课题之一。就迄今在分子进化研究中出现的问题看，把非线性问题不加条件地当作线性问题来处理的现象仍比较突出。,48,第四节 RNA的二级结构,1.RNA 二级结构的预测 X射线衍射方法是研究生物大分子结构的一个重要手段。用此方法已经测定了tRNA分子的三维结构。,49,大多数RNA分子的结构还不能直接用实验方法测定。因此用理论方法来预测RNA的高级结构（目前主要是二级结构）就显得尤为重要。RNA的二级结构是由RNA单链自身回折而形成部分碱基配对和单链交替出现的茎环结构（stem-loop structure）。RNA中的配对碱基通常为G-C,A-U,G-U。近年发现有其他形式的错配碱基对存在，如G-A等。茎区配对碱基间的氢键对二级结构起稳定作用。而环区的存在则使RNA分子的自由能升高，减弱二级结构的稳定性。然而，生物作用往往发生于环区或环与茎连接的部位。根据这些特点，在预测二级结构时，通常依照如下原则：生成自由能最小；碱基配对数最大；结构和功能统一。,50,最初所用的预测方法时点矩阵作图法（dot matrix construction）即给配对区域打点，不配对区域不打点，然后检索矩阵对角线点的模式。用这种方法得到的二级结构往往不是RNA分子自由能最低的结构。基于热力学方法而寻找具有最低自由能的二级结构预测方法，Zuker算法时其中比较典型的一种。Zuker算法对于预测RNA二级结构是比较有效的，它对tRNA二级结构的预测符合率达到80以上。但是这种方法计算时间长，大约是序列长度n的三次方（n3）。RNA是一个动态分子，特别是它表现出生物功能时，很可能不是其自由能最低的结构，而是以能量稍高一点的构象进行的，为了解决这个问题，Williams、Tinoc、Zuker等发展了生成次优化（suboptimal）折叠结构的算法，即寻找与最低自由能相差不大的能量所对应的二级结构。,51,2.影响RNA折叠结构稳定性的因素,预测RNA二级结构的思路和方法中所用的能量数据是在体外研究寡核苷酸的稳定性得到的，碱基配对的规则基本上是Watson-Crick型的。在能量计算过程中，规定折叠结构某一位置的能量仅受其最邻近的碱基影响。从这些规则可以看出，所预测的二级结构基本上是由RNA的一维核苷酸顺序确定的，折叠结构的稳定性主要寄托在碱基最大配对上。然而，近年来的研究发现，在RNA的折叠结构中有大量的碱基“错配”（mismatch）现象，折叠过程有蛋白质分子的参与。而且还发现除了水分子外，金属离子、碱基的修饰等作用对RNA折叠的稳定性起着很重要的作用。,52,（1）维持折叠（二级）结构稳定性的力 RNA的二级结构由碱基配对的双链区（茎）和非配对的单链区组成。由于单链区的能量为正，双链区的能量为负。所以，一般认为使二级结构稳定的力主要是双链区的碱基相互作用，这主要是碱基配对的氢键力，也有文献指出在进行二级结构的三维展开过程中发现，稳定二级结构的力主要是库仑力（Coulomb force），其次是色散力，最后才是氢键力（hydrogen-bond force)。而且，氢键力中非碱基配对的氢键力占了很大一部分。,53,关于RNA折叠结构中的“错配”现象，目前已有一些实验报道，例如锤头状ribozyme中的A-G,U-C错配在RNA折叠结构中也比较常见。碱基错配似乎对折叠结构的稳定性不太有利，但，目前的研究结果显示，这种不利因素有可能通过水分子、金属离子、和上下碱基的堆积相互作用而得到弥补。,54,（2）金属离子在RNA折叠结构中的作用,近几年来，对金属离子与RNA折叠结构的关系已有一些研究结果，其中研究的比较多的是tRNA中离子结合时的热力学和结构研究。一般来说，Mg2离子的结合位点有两类：第一类位点一般有较高的亲和性，在一些条件下，由于与RNA的结构变化耦合会表现出结合中的协调性，但这类位点数量较少；第二类位点的数量较多，它们有弱结合亲和性且是非专一性的，主要表现为离子与RNA主链磷酸的静电相互作用（electrostatic interactions）。,55,56,Mg2与tRNA的协调作用对于tRNA的正确折叠显然没有起根本作用。Mg2不会促进tRNA的复性，但除Mg2外的多数二价和三价离子是有效的。一些核酶只有Mg2存在时才有活性。从现有资料看，Mg2与磷酸氧、羟基和环上的氮的协调作用在核酶的活性位点中都是基本的方式。在一些情形中，Mg2是稳定核酶过渡态的相关因子；在另一些情形中，Mg2对于稳定RNA的三级结构很可能起着间接作用。,57,金属离子对RNA折叠结构的稳定性有一定的作用。前面提到的锤头状核酶中碱基错配区域附近有Mg2存在，碱基的错配降低了折叠结构的稳定性，而Mg2的存在可能是对折叠结构稳定性的一个补充，当然这也不排除水分子和其他蛋白质分子等的作用。总之，金属离子（特别是Mg2）与RNA的相互作用是研究RNA结构的一个重要方面，但现有的结果还主要是来自实验，以上结果还主要是一些定性的结果。从理论上对这些相互作用做定量研究对于弄清楚RNA的结构和功能都是很有意义的。同时，除以上介绍的作用方式外，金属离子与RNA是否还存在其他作用方式，这些问题都还有待于进一步的研究。,58,（3）碱基的修饰对于折叠结构的影响,在体内，大多数功能性RNA分子会被一些功能性基团所修饰，这些修饰的结果对于RNA折叠有很重要的影响。对tRNAala由二维核磁共振的研究结果表明，碱基的修饰增加了金属结合位点的强度。同时，碱基修饰会影响水分子的组织，从而影响大分子的稳定性。碱基的修饰有助于稳定二级结构。碱基修饰也许在折叠过程中是很重要的，但对于折叠好的结构影响不是很大,59,（4）水分子的作用,RNA分子处在溶液环境中，它周围的水分子能与它的一些基团发生氢键相互作用，这对RNA的折叠结构起着很大的稳定作用，特别是对于RNA折叠结构中的碱基错配区域，这种作用就更明显。,60,第五节 RNA的三级结构,RNA二级结构中的结构单元间的碱基在空间上会发生长程相互作用（long range interaction），从而形成RNA的三级结构。RNA主链的成分对于RNA的三级相互作用是很重要的。特别是糖环上的2羟基，它能与多种成分形成氢键。水分子、金属离子等对三级相互作用也会产生影响。RNA一级结构折叠成三级结构一般分为两步：通过碱基配对，核苷酸链折叠成二级结构；二级结构通过氢键和其他三级相互作用再折叠形成三级结构。,61,在折叠过程，首先是双螺旋区的成核作用，进而是二级结构单元之间的缩合（polycondensation），最后形成具有较低生成自由能的、在系统条件下具有生物功能的三维结构。,62,第六节 RNA的折叠,对于一条新生的RNA多聚核苷酸而言，如果它是自由伸长的，那么其长度将大大超过包装它的“生物容器”的尺度。因此要求RNA必须极紧密地压缩（condensation）使得与装容它的空间尺度相适应。多年来科学家们对RNA折叠（folding）或包装（packaging），如RNA是折叠为某一特殊的模式还是对不同的情况有不同模式很感兴趣。RNA折叠的主要特点是单链回折形成双螺旋和单链交替出现的茎环结构。这种结构的基本结构单元是发夹（hairpin）。,63,RNA折叠结构的结合模块可分为：假结（pseudoknots）、环、RNA的错配（mispairing regions）、核苷的三联相互作用、四体（quadruplexes）和U转折（U-turns)等。其中假结是一种具有高的分子识别本领的结合模块。RNA的折叠可能不是能量最低的稳态，而是亚稳态（metastable state），由于RNA链折叠速度很快，它以最有利的途径折叠成能量较低的亚稳态。这是一种动力学上的容易达到的亚稳态。RNA要达到最稳态，往往需要越过很高的能量壁垒，而且折叠途径是极为复杂的，也是动力学上不允许的。,64,在活细胞中，RNA是边合成边折叠，并且以先折叠的发夹结构为中心，后来形成的发夹按能量上有力的立体化学选择作空间排布，进而通过三级相互作用紧缩为能量较低的三维动态结构，在生物体中通过分子间相互作用、调节和控制执行其生物功能。在RNA的折叠中，除了由RNA分子的主链本身的特征结构和由它的碱基序列所决定的一些控制因素外，环境因素如金属离子、水分子、碱基修饰等的作用也不可忽视。,65,另外，有些RNA的折叠中，蛋白质分子还起着不可缺少的作用。Hall发现有些RNA分子只有在蛋白质存在的情况下才能折叠，且在RNA折叠过程中，蛋白质的结构几乎没有发生变化。通过生物化学分析又发现RNA和蛋白质共折叠现象。在这个过程中，RNA和蛋白质的构象均有改变。动力学分析也揭示了在RNA折叠中核蛋白壳（nucleocapsid）蛋白通过消除“错误折叠陷阱”（misfolded trap）或消除缺乏活性的构象而起一种分子伴侣（chaperone）的作用。,66,总之，RNA在遗传信息传递过程中的地位和作用已是人所共知的，而各种RNA的折叠结构对于它们体现各自的生物学功能又是至关重要的。特别是mRNA，它不像tRNA和rRNA那样具有一些保守的折叠结构特征，然而也许正是它复杂而多样的折叠结构决定着基因的表达和调控，直至影响蛋白质的结构。由此可见，研究RNA的折叠对于研究分子生物学和分子遗传学都具有一定的指导意义。随着对RNA的X射线衍射分析和NMR研究以及对RNA的生物化学研究的深入，一方面拓宽了我们对RNA结构的复杂性和多样性的认识，另一方面也为我们从理论上进一步研究RNA的折叠机制和折叠路径等提供了必要的结构数据。如RNA的motif结构和热力学参数，以及motif结构之间的三级相互作用特点，使得最终建立比较理想的RNA折叠模型。,67,作为一种常见的生物大分子，RNA的折叠具有一些和其他大分子折叠相同的特性。RNA折叠问题的阐明可能给其他大分子结构研究提供有用的信息。RNA主要有如下特点：基本组成单位比较简单有很强的形成二级结构的倾向分子的柔性比较大，容易发生构象变化RNA主链上的多个磷酸基团导致分子内斥力较大，需要溶剂内的正离子中和其负电荷，因此其构象受正离子强度的影响。,68,第七节 RNA的结构和晶体结构,69,一、RNA一级结构的特点,RNA一级结构研究最多的是tRNA、rRNA以及一些小分子的RNA。其中tRNA分子具有以下特点：分子量25000左右，大约由7094个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。分子中含有较多的修饰成分。3-末端都具有CpCpAOH的结构。,70,1、mRNA一级结构的特点,真核细胞mRNA的3-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为“尾结构”，5-末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为“帽结构”。,71,极大多数真核细胞mRNA在3-末端有一段长约200核苷酸的polyA。polyA是在转录后经polyA聚合酶的作用而添加上去的。原核生物的mRNA一般无polyA，但某些病毒mBNA也有3-polyA,polyA可能有多方面功能,与mRNA从细胞核到细胞质的转移有关；与mRNA的半寿期有关，新合成的mRNA的polyA链较长，而衰老的mRNA，polyA链缩短。,72,5端有甲基化的“帽子”结构,73,动物细胞核糖体rRNA有四类：5SrRNA，5.8SrRNA，18SrRNA，28SrRNA。许多rRNA的一级结构及由一级结构推导出来的二级结构都已阐明，但是对许多rRNA的功能迄今仍不十分清楚。,74,2、RNA高级结构的特点,RNA是单链分子，因此，在RNA分子中，并不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成突环。这种结构可以形象地称为“发夹型”结构。,75,在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA中严格。G除了可以和C配对外，也可以和U 配对。G-U配对形成的氢键较弱。不同类型的RNA,其二级结构有明显的差异。tRNA中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部分.,76,（1）、tRNA的二级结构,A、tRNA的二级结构tRNA的二级结构都呈“三叶草”形状，在结构上具有某些共同之处，一般可将其分为五臂四环：包括氨基酸接受区、反密码区、二氢尿嘧啶区、TC区和可变区。除了氨基酸接受区外，其余每个区均含有一个突环和一个臂。,77,氨基酸接受区 包含有tRNA的3-末端和5-末端，3-末端的最后3个核苷酸残基都是CCA，A为核苷，氨基酸可与其成酯，该区在蛋白质合成中起携带氨基酸的作用。反密码区 与氨基酸接受区相对的一般含有7个核苷酸残基的区域，其中正中的3个核苷酸残基称为反密码,78,二氢尿嘧啶区 该区含有二氢尿嘧啶。TC区 该区与二氢尿嘧啶区相对，假尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷环(TC)由7个核苷酸组成，通过由5对碱基组成的双螺旋区(TC臂)与tRNA的其余部分相连。除个别例外，几乎所有tBNA在此环中都含有TC。可变区 位于反密码区与TC区之间，不同的tRNA该区变化较大。,79,（2）、tRNA的三级结构,在三叶草型二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的tRNA的三级结构均为倒L型,80,81,（3）rRNA的结构,82,三、RNA的晶体结构,83,84,核酶的发现获1989年noble奖,第八节 具有催化功能的RNA,T.Cech,S.Altman,85,核酶是T.Cech等（1981年）在研究四膜虫rRNA时发现的，1982年T.Cech将核糖核酸（ribonucleic acid）和酶（enzyme）这两个词“重组”成一个新的词：“Ribozyme”,它是指本质为RNA或以RNA为主含有蛋白质辅基的一类物质，这类物质具有催化功能，但和酶又有区别，主要表明在两个方面：一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是RNA或带有蛋白的RNA；核酶既是催化剂又是底物，随着反应的进行，本身也消失了。而酶却不同，仅催化反应，反应前后其本身的质和量都不发生改变。,86,87,核酶的发现是分子遗传学和生物化学中的一项重大突破。其意义是：突破了酶的概念.人们一直笃信具有蛋白质性质的酶才能催化生化反应，核酶的发现使人们了解了RNA本身也可具有催化功能，但和酶的催化机制不同，是一种自体催化；揭示了内含子自我剪接的奥秘；促进了RNA的研究。为生命的起源和分子进化提供了新的依据。核酶反映了进化的早期阶段RNA既是信息的载体，又具有催化的功能，在进化的过程中这两者开始歧化，将携带信息的功能交给DNA，使得遗传信息更为稳定、丰富；将催化的功能交给蛋白，使得催化功能更为特异和多样。,88,核酶催化的反应分为自体催化和半自体催化两类。自体催化包括类内含子的自我剪接；型内含子的自我剪接；植物类病毒和拟病毒的自我剪切。半自体催化包括：核mRNA内含子的剪接；锥虫SLRNA的反式拼接；tRNA5加工，此项不属于转酯反应，但也是核酶的活性之一。,89,90,Chambon等分析比较了大量结构基因的内含子切割位点，发现有2个特点：内含子的两个末端并不存在同源或互补序列。在剪切的初始阶段，可能直接连接；连接点具有很短的保守序列也称为边界顺序。100种内含子的5端都是GT；3端都是AG，因此称为GT-AG法则（GT-AG rule），又称为Chambon法则。这两个位点序列是不同的，,91,左边的剪接位点称供体（donor）位点，右边的剪接位点称受体（acceptor）位点。这两个位点对于剪接是十分重要的，一旦发生突变无论在体内还是在体外，会抑制剪接。此法则几乎适合于所有真核生物的核基因，这意味着它们切除内含子的机制是相同的，但不适用于类内含子。,92,型自我剪接内含子在线粒体基因组中发现，也存在于极少数单细胞真核生物(如嗜热四膜虫的rRNA)的核基因组中。原核体系中少数内含子也是型内含子（如T4噬菌体胸苷酸合成酶基因）。Cech等1981年用四膜虫（Tetrahymeno thermophila）为材料来研究真核生物染色体的结构对基因表达的影响。,型内含子,93,94,95,类内含子的结构特点是：其边界序列为5 U G3（表示剪切位点）；具有中部核心结构（Central core strucature）。所有的类内含子中都具有2级结构，四膜虫内含子中二级结构模型，共九个配对区（P1-P9）其中有2个配对区（P4和P7）是类内含子中共有的保守序列，P4由P和Q序列形成，长10nt，有6-7碱基是可以配对的。P7是由R和S序列构成的，长12nt，但只有5个碱基可配对。其他的配对区在不同的内含子中是不同的，突变分析表明，P3，P4，P6，P7是核心结构，也就是可以执行催化的最小区域。具有内部引导序列（internal guide sequence IGS）。,96,97,核酶具有多种催化活性，对于类内含子来说这些活性是由于它可以产生特殊的二级和三级结构，形成活性位点，相当于传统酶的激活位点。就表示在这些位点上进行的剪接反应。内含子的二级三级结构形成了G苷酸结合位点和底物结合位点，后者依赖于内部引导序列的配对来确定。核心结构和内部引导序列又使这两个位点彼此靠近，便于相互作用。,98,先是GTP进入G结合位点，左边外显子的3端通过和引导序列的互补配对进入底物位点。GTP的3-OH作用左边外显子和内含子交界处的磷酸二酯键，本身结合到内含子的5末端，被切下的5外显子仍保持在底物位点上，并未游离。第二步内含子的G414（即3交界序列上的G）又进入了G-结合位点，切下的外显子的3-OH又对G-结合位点上的G与3外显子之间的磷酸二酯键发动亲核进攻，切开磷酸二酯键，而其3-OH和3外显子的P重新形成磷酸二酯键而连接起来，这样就完成内含子的剪接。内含子成为线形的413nt的RNA分子。第三步，内含子5端和引导序列相邻的序列通过引导序列互补配对，进入底物位点。仍然留在G结合位点上的G414其3-OH再作用底物位点上的序列，切下19nt的内含子5端，并和余下内含子的5-P形成二酯键，形成414nt的环状内含子。,99,型内含子,型内含子在植物和低等真核生物的细胞器基因组中发现。类内含子的剪接和I类内含子不同，而和核mRNA 内含子的剪切有些相似。但也有不同之处。,100,结构特点序列为5GUGCGYnAG，符合GT-AG法则。二级结构的形成使两个并列的功能区靠近。功能区5和功能区6被2碱基隔离开。功能区6含有1个不配对A残基，其上带有2-OH首先进行转酯反应。在内含子的近3端具有分支点顺序（branch-point seguence），也就是在第6功能区有6-12nt保守序列，在哺乳动物中为YNCURAY（Y：嘧啶，R：代表嘌呤，N表示任何核苷酸）。分支点顺序可和上游序列互补，形成茎环，但A不配对。,101,102,剪接机制,II型内含子的剪切机制,103,核mRNA的剪接,和类内含子十分相似，但根本的不同点是核mRNA前体的剪接本身不能形成二级结构，必需依赖于snRNP（U1，U2，U4，U5，U6）的帮助才能形成剪接体，进行自我剪接。它们自己本身不能象I类及类内含子那样依赖核心结构，形成茎环，将5和3剪切点拉在一起。和snRNA的结合是相当复杂的，但剪接反应的第一步5位点的剪接是由U6催化的，3位点是由5外显子1的3-OH对内含子3端切点进行转酯反应来完成。,104,结构特点,边界顺序:其边界序列是完全符合GU-AG法则。分枝点顺序：它和类内含子相似也具有分枝点顺序。位于内含子3端上游18-40nt处，序列为Py80NPy87Pu75APy95其中A为百分之百的保守，且具有2-OH。内含子5端有一保守序列（5GUAAGUA3）可以和U1 snRNA的5端的保守顺序3CAUUUCAU5互补,105,剪接机制核mRNA剪接的过程，实际上要比这复杂得多，首先要解决的是如何识别剪接位点，一般是通过两种途径：存在一种酶可以特异识别它们，并将两者的保守序列拉到一起；通过RNA的碱基配对产生二级结构，再由一种酶来识别。,核mRNA剪切过程,106,核mRNA的剪接可能要依赖于反式作用RNA（trans-acting RNA）。在高等生物中都含有很多的不连接的小分子RNA片段，在高等生物中其长度在100-300nt，在酵母中长度可达1000nt，其丰度很高。仅限制在核内的这些RNA称为小分子核内RNA（small nuclear RNAs,snRNA）。在细胞质内的称为小分子胞质内RNA(small cytoplasmic RNAs,ScRNA)。在自然状态下，它们以核糖核蛋白（snRNP）的形式存在。在剪接装置中会有几种snRNPs和大量的附加蛋白，常称为剪接因子,这些snRNPs是U1，U2，U5和U4/U6。U1，U2和U5 snRNA每种都含有单个的snRNA和几种蛋白，而U4/U6含有U4和U6 snRNAs及几种蛋白。U1 snRNA自我配对形成了多个茎环结构，从而构成了不同的功能区。,107,Sm结合位点是和其他snRNP相互作用的区域。其5末端有一保守序列：3CAUUCAU 5，这一序列可与核mRNA内含子5端的边界序列互补结合，这对于剪接反应是很重要的。以腺病毒12S RNA的5端边界顺序为例，如果此序列发生突变，从GUGAGG突变成为GUGAAU，虽然仅二个碱基发生突变，配对的碱基数仍然未变，仅减少了一个氢键，结果不能剪接。若在此基础上U1 RNA的5端序列也发生相应的突变，使得突变的碱基也能配对，结果又恢复了剪接的能力（图13-31）。由此可见U1 RNA 5端保守序列和内含子5剪接位点的配对对于剪接反应来说是十分重要的。其作用可能是通过配对使URNP可以和核mRNA3剪接位点牢固地结合，再通过U1和其他snRNP的相互作用使5剪接接点与3剪接位彼此靠近，弥补了核mRNA本身不能通过形成特殊的二级结构将两个剪接位点拉近的问题。使剪接能顺利进行。,图13-31 U1和内含子5的互补对剪切是重要的,108,图13-32表示snRNAp的剪接功能和反应步骤。第一步是U1通过和5剪接位点的配对和5位点结合。但U