《RNA提取系列》PPT课件.ppt

核酸纯化系统,TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD,RNA提取专项,RNA相关知识及提取原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护,AAAAAA,RNA相关知识及提取原理细胞中RNA的种类和含量,RNA相关知识及提取原理RNA的裂解原理,异硫氰酸胍/苯酚法,细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离,胍盐/-巯基乙醇法,盐酸胍裂解样本，抑制RNase的活性-巯基乙醇变性蛋白,RNA相关知识及提取原理RNA吸附原理,沉淀法介质吸附,RNA相关知识及提取方法原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护,RNA提取流程,1、样本前处理2、细胞裂解3、RNA的纯化及获得,RNA提取流程 样品前处理注意点,选择新鲜血液，不得超过4小时,选择新鲜的幼嫩组织,选择处于生长旺盛的时期收集细胞,选择新鲜组织，生长旺盛的组织,可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞然后加入一定量的TRNzol，-70保存较长时间,去掉培养基，加入一定量TRNzol-70 保存较长时间,推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存,液氮或加入RNase抑制剂中保存，避免反复冻融,RNA提取流程 样品前处理中如何保存样本,样品的前处理方式,RNA提取流程样本前处理的目的：离散，均一，细胞集或细胞液,液氮研磨,匀浆或液氮研磨,应用红细胞裂解液处理,蛋白酶K处理,RNA提取流程样品前处理Q&A,Q-1：样品量是否越多越好？A-1：不是。在试剂盒规定内增加，若过度增加样品处理量会影响RNA得率；如增加样品起始量，则后续实验中各溶液量均要相应按比例增加。,Q-2：如何保证研磨过程和匀浆中RNA不被降解？A-2：研磨过程要迅速，同时尽量避免外源RNA酶污染；匀浆过程中一定要保证组织和裂解液充分接触，尽量在匀浆前将组织低温切割成小块加入裂解液中，可确保RNA不被降解。,RNA提取流程样品前处理Q&A,1、样本前处理2、细胞裂解3、RNA的纯化及获得,RNA提取流程,RNA提取流程细胞裂解，以释放RNA,异硫氰酸胍/酚TRNzol总RNA提取试剂,独特配方-RNAplant植物RNA提取试剂,胍盐/-巯基乙醇RNAprep系列RNA提取试剂盒,RNA提取流程,1、样本前处理2、细胞裂解3、RNA的纯化及获得,RNA提取流程 RNA的纯化及获得,RNA纯化要求,1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质2 排除有机溶剂和金属离子的污染3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4 排除DNA分子的污染,RNA相关知识及提取原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护,实验举例,使用试剂（以TRNzol A为例）使用试剂盒（以RNAprep pure试剂盒为例）,操 作 流 程,样品前处理、细胞裂解,试剂,试剂盒,纯化,沉淀,加入吸附柱,洗涤,溶解RNA沉淀,获得RNA产物,加缓冲液,漂洗,RNA洗脱收集,细胞,实验举例应用TRNzol-A+提取动物细胞RNA,细胞选择,贴壁细胞 悬浮细胞,样品处理量与加入的TRNzol-A+的量要对应1mlTRNzol-A+对应：1 血液0.2-1ml 2 动植物组织30-50mg 3 贴壁细胞：每10cm2培养面积 4 悬浮细胞：5-10106细胞,等体积异丙醇沉淀,70乙醇洗涤沉淀,晾干溶解,RNA吸附柱,去蛋白液,漂洗,洗脱,水相RNA,传统方法：有机溶剂抽提，得率高,柱纯化法：纯度高,实验举例应用TRNzol-A+提取动物细胞RNA,图片说明：M:TIANGEN Marker IIIA:A公司同类产品提取动物细胞结果T:TIANGEN公司TRNzol-A提取动物细胞结果,试验材料：Hela cell/106实验方法：TIANGEN公司 TRNzol-A+A公司同类产品试验结果：得率：TRNzol-A+得率与A公司同 类产品略高 纯度：经TRNzol-A+纯度较高，无明显DNA、蛋白残留,M,T,A,1 2 3 4 5 6,实验举例应用TRNzol-A+提取动物细胞RNA,实验注意事项应用TRNzolA的注意点,前处理,裂解,沉淀,洗涤,抽提,溶解,RNA降解,处理样品量,上清吸取，杂质去除,适量异丙醇,乙醇，盐离子残留,RNA不宜太干,操 作 流 程,样品前处理、细胞裂解,试剂,试剂盒,纯化,沉淀,加入吸附柱,洗涤,溶解RNA沉淀,获得RNA产物,加缓冲液,漂洗,RNA洗脱收集,实验举例应用RNAprep pure提取动物组织,动物组织,研磨或匀浆,植物组织30-50mg动物组织10-20mg悬浮细胞107贴壁细胞10cm2血液,胍盐、-巯基乙醇裂解细胞灭活RNaseRNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合RW1除去蛋白残留RW除去盐离子在漂洗过程中利用DNase 除去基因组DNARNA在底盐高PH条件下被洗脱用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA,裂解,结合,漂洗,洗脱,实验举例应用RNAprep pure提取动物组织,胍盐、-巯基乙醇裂解细胞灭活RNaseRNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合RW1除去蛋白残留RW除去盐离子在漂洗过程中利用DNase 除去基因组DNARNA在底盐高PH条件下被洗脱用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA,裂解,结合,漂洗,洗脱,实验举例应用RNAprep pure提取动物组织,胍盐、-巯基乙醇裂解细胞灭活RNaseRNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合RW1除去蛋白残留RW除去盐离子在漂洗过程中利用DNase 除去基因组DNARNA在底盐高PH条件下被洗脱用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA,裂解,结合,漂洗,洗脱,实验举例应用RNAprep pure提取动物组织,胍盐、-巯基乙醇裂解细胞灭活RNaseRNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合RW1除去蛋白残留RW除去盐离子在漂洗过程中利用DNase 除去基因组DNARNA在底盐高PH条件下被洗脱用经DEPC处理过的水或专门的缓冲液洗脱或溶解RNA,裂解,结合,漂洗,洗脱,实验举例应用RNAprep pure提取动物组织,试验材料：大鼠肝脏/10mg实验方法：TIANGEN公司 RNAprep pure KitA公司某柱式RNA提取试剂盒试验结果：得率：RNAprep pure 得率比A公司产品高15左右高纯度：纯度较高，且无盐份残留,TIANGEN A公司,TIANGEN A公司,M,TIANGEN,A,实验举例应用RNAprep pure提取动物组织,裂解,结合,漂洗,洗脱,控制提取样品量,防止堵柱或漏柱,盐离子去除,得率控制,实验注意事项应用RNAprep pure的注意点,RNA回收率,实验注意事项洗脱体积与得率关系,RNA相关知识及提取方法原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护,一些特殊组织的RNA提取,纤维组织蛋白/脂肪含量高组织核酸/RNase含量高组织植物组织/真菌组织,彻底破碎,多次氯仿抽提,减少处理量，多次氯仿抽提,多次氯仿抽提，特殊试剂,RNA相关知识及提取方法原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护,RNA的评价与鉴定,纯度（OD260/OD280）：紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在0.11.0之间，通常离心柱法稀释10倍左右；溶液裂解法稀释4050倍）OD260/OD280 1.9 2.1说明有部分降解得率紫外分光光度计进行测量；Yield OD260稀释倍数40ng/ul电泳检测 1琼脂糖，6V/cm，15min，上样13 ul,M 1 2 M 1 2,RNA相关知识及提取方法原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护,RNA的保护RNA的不稳定性,内因：核糖残基的2和3位置带有羟基，易被水解外因：内源、外源RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活,RNA的保护常用的RNA酶抑制剂,焦碳酸二乙酯（DEPC）异硫氰酸胍 RNasin 氧钒核糖核苷复合物 SDS、尿素、硅藻土等,RNA的保护提取前的保护,材料样品中的RNA保护RNA提取工作区RNase的清除实验耗材，器皿的RNase清除,塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡4-10小时，再灭菌 玻璃器皿可在180烘烤4小时 塑料制品和枪头避免交叉污染,RNA的保护提取过程中的RNA保护,组织破碎细胞裂解实验人员,适当的破碎方法,适量的裂解液,正确的操作和防护措施,RNA的保护保存过程中及后续实验中的RNA保护,保存过程 RNAsafe后续实验 RNasin,TIANGEN让您的RNA实验更顺利！,TIANGEN公司RNA提取试剂/盒,硅胶膜吸附法,硅胶膜吸附法,DP315TIANamp病毒DNA/RNA提取试剂盒,DP421TRNzol-A总RNA提取试剂,RNAprep pure系列试剂盒,DP430RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒,DP431RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒,DP432RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒,DP433RNAprep pure血液总RNA提取试剂盒,DP420RNAprep pure微量总RNA提取试剂盒,TRNzolA总RNA提取试剂,RNAprep pure总RNA提取试剂盒,1 样品预处理方式相同2 裂解原理不同3 RNA纯化原理不同：TRNzolA：有机溶剂抽提，异丙醇沉淀 RNAprep pure：硅基质吸附膜分离纯化,分析比较,RNA提取方法比较,RNA提取得率比较,TIANGEN公司RNA相关试剂/盒,RNA样本保存试剂,RNA保护试剂,RNA纯化试剂盒,DP408RNAstore组织样本保存液,DP412RNAcleanRNA纯化试剂盒,DP409RNAsafeRNase抑制剂（用于保存RNA）,DP418RNasin用于RT等下游实验,TIANGEN公司新产品RNAstore Reagent,原 理：一种液态的、无毒的组织保存试剂，通过迅速渗入组织细胞中，抑制RNase活性，从而保护样本中的RNA不发生降解，维持RNA的完整性。适用范围：动物组织样本 细菌 组织培养细胞 全血中的白细胞,天根产品RNAstore Reagent优势分析,延长保存时间 常温1周、37 1天、4至少保存1个月；组织4浸泡过夜后-20或-80可长期保存 方便操作 样本取出后，可方便进行切割、称重等操作 可反复冻融 冻存于-20或-80的组织可反复冻融至少20次不影响RNA质量不影响下游应用 从RNAstore取出样本后，可直接使用TRNzol、RNAprep pure、RNAsimple等RNA提取试剂盒提取,天根产品RNAstore Reagent实验结果,反复冻融实验结果,保存时间实验,下游试剂兼容性实验,天根产品RNAstore Reagent实验结果,