《pcr的发展历程》PPT课件.ppt

PCR的发展历程,PCR技术的基本原理 PCR：聚合酶链式反应。1983年由美国科学家Kary Mullis提出，1993年因此而获诺贝尔奖。PCR技术是指通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术，它包括变性、退火、延伸三个步骤。,模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,标准的PCR反应体系：10扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模 板和Mg2+,PCR的发展史 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶，此酶的发现使PCR广泛的被应用。,第一代：手动/机械手式水浴基因扩增 用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在三个温度：PCR的高温变性温度（如94）低温复性温度（如58），适温延伸温度（如72）。再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴。这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易因疲劳引起差错；而优点是:设备简单，投资少，与自动化基因扩增仪相比，它无须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR反应条件。,第二代：自动化控制型PCR,特点：使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电泳的方式对PCR产物进行分析，但存在着操作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风险大等不足。,第三代PCR：实时荧光定量PCR,为了避免上述传统PCR的缺陷，并对基因的表达水平进行定量分析，1992年诞生了所谓“第三代PCR的荧光定量实时PCR。所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧、光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定、量分析的方法。,数字PCR 由于定量PCR的分析最终结果依赖于Cq值，在这个意义上所谓的“定量”也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下，“数字 PCR应运而生。数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于实时荧光定量PCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。,谢谢！,