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    《PCR技术教程》PPT课件.ppt

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    《PCR技术教程》PPT课件.ppt

    聚合酶链式反应(PCR)原理与相关技术,一、PCR技术,二、定量PCR技术,三、数字PCR技术,一、PCR原理,Polymerase Chain Reaction(PCR):在体外特异性地扩增某个基因。,1、历史,1971年,Khorana提出体外人工复制DNA的设想。1985年Cetus公司科学家使设想变成现实,采用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断(37),并获1993年诺贝尔化学奖。1988年R.K.Saiki 应用Taq DNA聚合酶(水生栖热菌)于PCR反应;同年,Cetus公司发明自动热循环仪。,2、原理,特异性强、灵敏度高、快速、简便,1、Taq酶:具有53聚合酶和外切酶活性,无35外切酶活性,不能修复错误的碱基配对,因此必须测序。需激活剂:Mg2+2、pfu DNA 聚合酶:有53和35外切酶活性,出错率最低,但PCR产物平端。3、Taq Plus DNA 聚合酶:是Taq和pfu的混合物,Taq PCR产物3端带A。4、引物:互补;引物长度;3碱基序列必须与模板配对;尽量提高GC含量;避免连续相同碱基排列或开成回纹结构;避免形成引物二聚体。5、Tm=(G+C)4+(A+C)26、primer 5.07、模板纯度:不一定要纯,但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、Mg2+螯合剂等。模板量(100ng/100l)8、dNTP浓度2.5 mM each,特殊说明:,普通PCRRT-PCRTAIL-PCR Real-time PCR数字PCR,PCR类型:,普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR仪,定量PCR仪,数字PCR仪,二、实时荧光定量PCR(Real-time quantification PCR),1、历史,实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它的特异性更强、更能有效解决PCR污染问题、自动化程度更高等特点。,原理:在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料(如SYBR GREEN 1)或特异性的荧光探针(如Taqman探针),利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程,再通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。也就是通过荧光的变化,获得不同样品达到一定荧光信号(阈值)所需要的循环次数Ct(Cycle Threshold)。Ct值的含义:每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。,1、荧光探针和荧光染料:分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物,前者特异性高,后者操作简单。,SYBR GREEN 1:结合双链DNA小沟后,荧光强度增强,但也会结合引物二聚体或单链引起的二级结构。变性时,双链分开,荧光消失。,特别说明:,TaqMan探针:寡核苷酸探针,荧光基团连接在5端,淬灭基因连在3端。5端荧光基团吸收能量后转移给临近的3端淬灭基团,发生共振能量转移(FRET),只要探针完整,能量就会被淬灭。,荧光定量PCR的优点,荧光信号的强弱可实时反映DNA的扩增;灵敏度极高,用于准确定量初始模板数量;既能用于定性,判断一段DNA序列的有无,也可用于定量,确定起始DNA拷贝数。,一对引物,引物之间一条寡核苷酸,即探针,报告基因与淬灭基团,完整探针,不发光;水解后,发光。,FRET,变性(95),退火(60),DNA聚合酶,53外切酶活性;可将探针5端的荧光基团切割下来。,荧光基团游离下来后发光了!,因为探针是完全与目的基因互补,当它被水解后就发光,因此发光的强度与目标基因量成正比。,只与双链结合,发光;不与单链结合,不发光。,随温度升高,DNA双螺旋结构降解程度的曲线即熔解曲线,可用对数图和线性图表示。在扩增产物的溶解温度上有一特征峰(Tm,DNA双链解链50的温度),用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开,因为它们在不同的温度溶解。,卤素灯(白光),定量,线性图与对数图正好相反,基线期在对数图中增高。,基线:扩增线中的水平部分,由环境的噪音产生。实验结束软件自动分析数据,基线取默认值3-15(循环数)。如果最小的Ct值18,保持默认;如果最小的Ct值18,基线终点改成最小的Ct值减3,重新分析。,荧光阈值:在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段的任意位置上。,默认阈值基线(背景)荧光信号的标准偏差的10倍。,Ct值的含义:每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。,DNA0:样本起始DNA浓度。,理论上PCR是一个指数增长的过程,但实际的PCR扩增曲线并标准的指数曲线,而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多,扩增规模迅速增大,Taq酶、dNTP、引物,甚至DNA模板等各种PCR因素逐渐不满足要求,PCR效率越来越低,产物增长的速度逐渐减缓。,绝对,处理与对照,定量PCR仪特点,,污染机会少,定量PCR的实验因素,DNA纯度:OD260/OD280=1.8,之间DNA用量:0.05-100ngRNA纯度:OD260/OD280=2.0cDNA用量:1-100ng总RNA反转录的cDNA取1l,样品和标准品都需要重复,重复次数遵循统计学要求。,定量PCR实验要素:目标基因:未知样品生成标准:曲线标准品梯度监控系统:阳性对照监控污染:阴性对照校准生物学误差:管家基因校准物理误差:参比荧光(ROX)降低其它误差:重复实验,ABI7500,96孔板,样品量大,仪器稳定,结果分析直观。ABI试剂ROX校正物理方面的误差:枪的误差(如试剂体积)耗材质量(如管盖厚度、透光性)仪器稳定性(如孔间、批间温度波动),Real-time PCR 方法的应用,绝对定量(Absolute Quantification):拷贝数;标准是已知拷 贝数的质粒DNA。相对定量(Relative Quantification):相对变化量;内标定量。,前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100%且 偏差在5%以内。,蛋白互作,三、,操作流程,我们班上的刘磊同学所拍,

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