《PCR技术介绍》PPT课件.ppt

,Polymerase Chain Reaction,PCR,多聚酶链式反应技术,以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成,包括Tris-HCl（维持PH值），KCl（利于引物的退火），Taq聚合酶保护剂,PCR的特异性（3端和5端；18-25bp；0.1-0.5M；Tm值；4种碱基随机分布；自身避免反向重复序列；引物之间不存在互补序列；3端选择保守的氨基酸序列；与非特异性序列的同源性）,PCR的合成原料，四种dNTP浓度应相等,耐高温，在热变性时不会被钝化,使DNA聚合酶具有催化活性,DNA/RNA，线性，小片段模板，核酸样品应除去存在对DNA聚合酶有抑制作用的有机溶剂和金属离子,实验参数设置,变性的温度与时间退火的温度与时间延伸的温度与时间循环数,PCR产物检测,琼脂糖凝胶电泳,EB，它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm365nm的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光,琼脂糖凝胶板的制备(1.5%),加样电泳（电压80V、时间2hr）,紫外,PCR技术,巢式PCR,原位PCR,多重PCR,定量PCR,逆转录PCR,逆转录 PCR,相对于基本PCR，在开始阶段增加步骤：RNA cDNA合成，是单链到双链的过程。,引物,逆转录酶,RNA水解酶,Real Time qPCR,荧光嵌合法(TB Green)荧光探针法,实时荧光定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,基线（Baseline）是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。光阈值（threshold）一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期Ct(Cycle threshold)值 表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,Real Time qPCR,。,固定循环数后，荧光信号与模板数成正比。初始DNA量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少。起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。,Real Time qPCR,熔解曲线,确认PCR反应的特异性。,Ct值无数值（undetected）阴性 Ct值30.0阳性Ct值30.0 表达量极少,Real Time qPCR,相对定量法分析结果,内参/管家基因,GAPDH、-actin、18S rRNA、ACTB、2M.（至少选择两个以上）,R=2Ct,核酸表达量计算,例：,Thanks,PCR,谢谢观看,