SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量.ppt

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量,一、实验目的二、实验原理三、实验步骤四、结果分析五、注意事项,一、实验目的,学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理。掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。,二、实验原理,SDS的性质与作用聚丙烯酰胺凝胶的性质,SDS的性质与作用,十二烷基磺酸钠(SDS)Sodium dodecyl sulphate CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+,Protein Strand,SDS Molecules,Denature,SDS的性质与作用,蛋白质变性 0.1-1%SDS 0.1 M 2-巯基乙醇蛋白质变与SDS分子按比例结合 1：1.4,SDS,SDS的性质与作用,聚丙烯酰胺凝胶性质,聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的。,聚丙烯酰胺凝胶(PAG)具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)还具有浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。,聚丙烯酰胺凝胶性质,X,Y,Z,+SDS,PAGE,SDS-PAGE,-,+,-,结果受分子量大小和电荷的影响,结果只与分子量大小有关,-,+,PAGE和SDS-PAGE的比较,三、实验步骤,制备分离胶制备浓缩胶电泳及染色凝胶板剥离与染色,配制分离胶溶液,制备分离胶,凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入。注胶过程要一次性完成,避免产生气泡。,加入分离胶溶液 pH 8.8,制备分离胶,封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。,配制浓缩胶溶液,制备浓缩胶,分离胶pH 8.8,制备浓缩胶,浓缩胶pH 8.6,分离胶pH 8.8,上样及电泳,开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。,凝胶板剥离与染色,电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.,影响电泳速度的外界因素,1.电场强度 2.溶液的pH值 3.溶液的离子强度 4.电渗现象 5.温度的影响 6.支持物的影响,四、结果分析,标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。,以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。,五、注意事项,1.丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，操作时应免避沾在脸、手等皮肤上。最好戴一次性塑料手套操作。2.过硫酸铵的主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合反应，故一定要新鲜，贮存过久的过硫酸铵商品不能使用。此外，10%过硫酸铵必须现用现配，4冰箱贮存不超过48小时。3.灌制凝胶时，应避免产生汽泡，因为汽泡会影响电泳分离效果。4.刚灌注分离胶混合溶液后，应在分离胶液面上加12cm高的水层，以阻隔空气。胶液面上加水层时要特别小心，缓缓叠加，以免冲坏凝胶的胶面。5.聚丙烯酰胺凝胶电泳耗时长，电泳过程中产热多，特别是夏天产热更多。故电泳过程中应安装循环冷却水以带走热量，或在4冰箱中电泳。,