RNA的生物合成、转录后加工和调节.ppt

暨南大学药学院,1,细胞与分子生物学,暨南大学药学院,2,内容,第四篇 遗传信息的储存、传递和调控16章 DNA的复制及损伤修复17章 RNA的生物合成、转录后加工和调节18章 蛋白质的生物合成及其加工修饰19章 基因表达的调控20章 重组DNA技术21章 基因诊断与基因治疗,暨南大学药学院,3,17章 RNA的生物合成、转录后加工和调节,暨南大学药学院,4,第一节 基因转录的基本性质,转录是以DNA单链为模板，NTP为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程。DNA上的转录区域称为转录单位 转录是基因表达的第一阶段也是基因调节的主要阶段。,暨南大学药学院,5,转录与复制的异同,暨南大学药学院,6,结构基因 DNA分子中编码RNA的区段模板链 Watson W链 负链编码链 Crick C链 正链不对称转录 不同基因的模板链核编码链并不是固定在某一条链上。,暨南大学药学院,7,RNA聚合酶特点：以核糖核苷三磷酸（rNTP）为底物；以DNA为模板；按53方向合成；无需引物的存在能单独起始链的合成；合成时，第一个引入的NTP是以三磷酸形式存在；在体内DNA双链中仅一条链作为转录的模板；RNA的序列和模板是互补的；RNA聚合酶无校正能力。原核生物的RNA聚合酶细菌中只有一种真核生物的RNA聚合酶真核生物有三类不同的,第二节 RNA聚合酶,暨南大学药学院,8,RNA的酶促合成,暨南大学药学院,9,一、原核生物的RNA聚合酶,大肠杆菌RNA聚合酶的组成450kd，5个亚基2个Alpha亚基参与全酶的组装及识别启动子亚基与NTP及新生链结合亚基与模板DNA结合亚基辨认转录起始点，延伸阶段与核心酶分离，一种转录辅助因子,暨南大学药学院,10,因子原核只有一种RNA聚合酶，但有多种因子在不同的条件下被表达，并与相应启动子结合基因启动子35和10区的保守序列是其识别位点,暨南大学药学院,11,RNA polymerase in prok.,Core Enzyme,Holo Enzyme,暨南大学药学院,12,基因 产物 功能,E.coli RNA Pol 的结构和功能,rpoA 2 亚基(每个40kD),酶的连接，装配启动子的识别结合某些活化因子,rpoB 亚基(160kD),rpoC 亚基(160kD),rpoD 亚基(3290kD),和底物结合,催化核心,和模板结合,和启动子结合识别模板链,暨南大学药学院,13,暨南大学药学院,14,RNA 聚合酶需执行多功能：识别DNA双链上的启动子；使DNA在启动子处解链成单链；通过阅读启动子序列，RNA聚合酶确定它自己的转录方向和模板链；最后当它达到终止子时，通过识别停止转录,暨南大学药学院,15,二、真核生物的RNA聚合酶,已发现有3种对抑制剂鹅膏覃碱的敏感性有差异转录产物不同,暨南大学药学院,16,转录何处开始？启动子DNA模板上被RNA聚合酶识别并结合形成转录起始复合物的区段。原核生物启动子真核生物启动子,第三节 与转录有关的DNA结构,暨南大学药学院,17,一、原核生物启动子,研究方法 足迹法p340起始点 A or G10区 一致序列TATAAT pribnow box35区 一致序列TTGACA 因子识别位点，全酶结合于此，Sextama box1035区间隔序列 长短比序列重要,暨南大学药学院,18,大肠杆菌启动子的保守序列,暨南大学药学院,19,RNA聚合酶I 的启动子rRNA 45s RNA，再加工成5.8s,18s,28s rRNA，启动子由核心启动子和上游的调控元件组成,二、真核生物启动子,暨南大学药学院,20,RNA聚合酶II 的启动子有3处顺式作用元件90的GC盒，70的CAAT盒，30处的TATA盒转录起点与原核生物相似，大多为A或GmRNA，种类繁杂，启动子多样性，还发现其它的相关元件。各种元件有不同的组合。II是最活跃的聚合酶。,暨南大学药学院,21,真核RNA聚合酶II启动子和增强子通过蛋白质的介导互相结合，形成环，启动转录,暨南大学药学院,22,真核启动子含有的各种元件和分布,暨南大学药学院,23,RNA聚合酶III的启动子催化snRNA,tRNA,5S RNA的转录需要其它辅助因子共同作用snRNA启动子与蛋白质基因启动子相似tRNA,5S RNA内部启动子,暨南大学药学院,24,真核RNA启动子的基因内启动子和基因外启动子,暨南大学药学院,25,真核启动子不同于原核的特点,有多种元件；结构不恒定；它们的位置、基序、距离和方向都不完全相同；有的有远距离的调控元件存在，如增强子、沉默子等；这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用；不直接和RNA Pol结合。,暨南大学药学院,26,转录的起始转录的延伸转录的终止,第四节 转录过程,暨南大学药学院,27,转录的起始,原核生物转录的起始真核生物转录的起始,暨南大学药学院,28,原核生物的转录起始,1.核心酶在因子的参与下与模板的DNA接触，生成非专一的，不稳定的复合物在模板上移动；2.起始识别：全酶与模板的启动子结合，产生封闭的“酶-启动子二元复合物”（closed binary complex）；3.酶紧密地结合在启动子的-10序列处，模板DNA局部变性，形成“开放的启动子二元复合体”（open binary complex）；4.酶移动到转录起始点上，第一个rNTP转录开始，因子释放，形成酶-启动子-rNTP三元复合体。,暨南大学药学院,29,E.coli转录的起始,暨南大学药学院,30,真核生物的转录起始,每种RNA聚合酶都需要一些蛋白质辅助因子，即转录因子，transcription factor（I,II,III类分别对应于聚合酶）,暨南大学药学院,31,RNA聚合酶I催化的起始,转录起始点上游有2个顺式作用元件，核心元件core element和上游调控元件UCE。RNA聚合酶I催化的转录需要2种转录因子，上游结合因子UBF和选择性因子1，SL1。SL1有4个亚基，一个是TATA盒结合蛋白TBP,另3个是TBP相关因子TAF。,暨南大学药学院,32,p342,UBF和UCE结合令DNA发生弯曲，使相距上百bp的UCE 和核心元件靠拢，接着SL1和polI相继结合到UBF-DNA复合物上，完成复合物的组建，开始转录。,暨南大学药学院,33,Allows RNApol binding complex to initiate,暨南大学药学院,34,RNA聚合酶II催化的起始,转录因子：需要较多的转录因子参与转录起始复合物的组装：TFII-D与TATA盒结合，如无TFII-A的存在，TFII-D启动子复合物与抑制因子结合。TFII-A存在时与TFII-D结合成D-A复合物，防止复合物与抑制因子的结合，继而与TFII-B结合。聚合酶与TFII-F先形成复合物后再结合到DNA上，此时不能启动转录，必须TFII-E和TFII-H/TFII-J的参与。TFII-H是最后加入的因子，有解旋酶的活性，使起始部位DNA解链。TFII-H还有蛋白激酶活性，使pol IIC端多个丝氨酸残基磷酸化，这是聚合酶离开起始点继续转录的重要因素。,暨南大学药学院,35,真核生物的转录,RNA Pol 的转录起始,暨南大学药学院,36,暨南大学药学院,37,Wilds minor groove,pre-TIC,Basic TIC,conclusion,暨南大学药学院,38,Promoter clearance,Transcription starting,暨南大学药学院,39,RNA聚合酶III催化的起始,需要3个蛋白质因子TFIII-A,B,C。tRNA基因转录的起始：在DNA上的调控序列位于起始转录位点的下游，称为内部启动子。有2个调控区，A盒和B盒。5s RNA基因转录的起始：除了TFIII-B,C外，还需要TFIII-A，首先TFIII-A结合到下游C盒，然后TFIII-C结合到A盒和B盒，继而是类似tRNA的转录,暨南大学药学院,40,暨南大学药学院,41,TFIIIB allows RNApol III to bindand initiate transcription,tRNA,+1,暨南大学药学院,42,rRNA,5s pre-rRNA transcription,暨南大学药学院,43,转录的延伸,延伸阶段，原核和真核比较相近。,暨南大学药学院,44,原核生物的延伸：核苷酸链中的的一个磷酸二酯键形成后，因子从全酶中解离出来，核心酶沿DNA分子移动。真核生物：RNA聚合酶需要较多的转录因子，起始后酶的移动也靠多种转录因子的共同作用使酶的构象发生改变来实现，如在TFII-H的作用下，polII C端丝氨酸的磷酸化是向下游移动的重要因素。,暨南大学药学院,45,转录的延伸,延伸时RNA 聚合酶以稳定收缩和突然伸展的方式在DNA上“爬行”，稳定的收缩是指RNA聚合酶从35bp长连续地收缩到28bp，然后前端又突然向前伸展8bp,RNA聚合酶又恢复到35 bp长。,暨南大学药学院,46,转录泡p345,在转录延伸的过程中，DNA双链需要解开1020bp，形成的局部单链区象一个小泡为了保持局部的转录泡状态，在RNA聚合酶下游的DNA需要不断的解链，可使其下游的DNA越缠越紧，形成正超螺旋，而其上游的DNA链变得松弛，产生负超螺旋。解旋酶和拓扑酶可以消除这些螺旋,暨南大学药学院,47,第一个磷酸二酯键的形成是由第一个核苷酸的3OH与第二个核苷酸的5磷酸之间脱水形成的。第一个核苷酸的5三磷酸保留在转录局部形成的RNA:DNA杂合双链之间的力比DNA双链的弱，存在A:U配对，延长中的RNA链的5端会被重新形成的DNA双链挤出，使合成中的RNA链的5端游离于转录复合物。,暨南大学药学院,48,转录的终止,生物转录的终止处有特殊结构的存在，称为终止子 在原核细胞中有两种不同的终止子，一种是强终止子，另一种是弱终止子。强终止子在体外实验中，无需其他任何因子的帮助就可以终止核心酶，这种终止子被称为内部终止子（intrinsic terminators）。弱终止子需要在一种蛋白质因子（rho factor）的帮助一才能终止，所以又称为依赖性终止子（Rho-dependent terminator）,暨南大学药学院,49,强终止子的结构,强终止子的结构有三个特点：有回文结构存在。由它转录出mRNA可形成茎环结构，可阻止RNA 聚合酶的前进；茎的区域富内含G-C，使茎环不易解开；强终止子3端上有6个U，由于它和模板形成的连续U-A配对较易打开，从而便于释放出RNA。,暨南大学药学院,50,弱终止子的结构,它也可形成茎环结构，但在茎中的G.C含量少，茎环易打开。在其3端也没有寡聚U，因此RNA 聚合酶合成此段RNA后，由于茎环的存在可使聚合酶暂停一下，若此时因子追上来和聚合酶结合，那么转录即可终止，若无因子聚合酶还可越过终止进行“通读”。,暨南大学药学院,51,RNA聚合酶转录mRNA因子附着到mRNA识别位点因子在RNA聚合酶后面沿mRNA移动RNA聚合酶在终止位点停留，因子赶上了聚合酶在转录泡中因子解开DNA-RNA杂合链终止RNA聚合酶，因子和RNA被释放,在原核mRNA转录中依赖性终止机制,暨南大学药学院,52,依赖性终止子，其共同特点是C丰富，G缺乏,暨南大学药学院,53,RNA聚合酶转录出mRNA后核糖体结合到mRNA上核糖体在突变位点解离因子追上了RNA聚合酶转录提前终止,无义突变时因子可能使转录提前终止,暨南大学药学院,54,原核转录的过程,暨南大学药学院,55,真核生物转录的终止,机制了解不多，且3种聚合酶的转录终止不完全相同。RNA聚合酶I催化的转录有18bp的终止子序列，可被辅助因子识别。RNA聚合酶II和III催化转录的终止子，可能有与原核生物不依赖因子的终止子相似的结构和终止机制，即有GC的茎环结构和连续的U。由于成熟的mRNA3端已被切除了一段，并加入了polyA尾巴，具体的转录终止点目前尚未认识。,暨南大学药学院,56,真核生物的转录终止,真核生物的RNA大部分都要经过加工，包括剪切和加上poly(A)，因此对于其终止的情况了解很少，只有少数的例子搞得比较清楚。前体RNA转录的终止是随着组织的变化而变化。例如在爪蟾中有两个重要的转录终止位点：T2和T3。T2是28SrRNA序列3末端下游约235bp序列。T3是排列在下一个转录单位的上游约200bp处。T2和T3都含有7个碱基的保守序列：5-GACTTGC-3。T2是前体rRNA转录的初始终止位点。T3是作为“失败-保险”的终止位点，由于rDNA转录单位是串联排列的，所以“失败-保险”终止系统让RNA Pol分子可能在一个转录单位上起始和转录。,暨南大学药学院,57,第五节 RNA转录后加工,原核生物RNA转录后的加工mRNA转录后的加工rRNA转录后的加工tRNA转录后的加工真核生物RNA转录后的加工rRNA转录后的加工tRNA转录后的加工mRNA转录后的加工,暨南大学药学院,58,原核生物RNA转录后的加工,mRNA的加工：mRNA转录产物，一般无需加工即具有活性，可作为翻译的模板。但近年也发现要添加3polyA的现象。tRNA,rRNA的加工修饰较多。rRNA的加工：rRNA基因常与一些tRNA基因混合组成一个操纵子，呈有序排列。RNA酶III对其转录产物进行切割，其产物还需再加工才成为成熟的rRNA，具体机制不明。,暨南大学药学院,59,原核生物RNA转录后的加工,tRNA的加工：原核生物tRNA的初始转录产物有几种形式，1、与rRNA相连；2、相同的几个拷贝连在一起；3、不相同的几个连在一起。要经过多个加工程序才能成为成熟的tRNA。参与tRNA加工的酶类有多种包括：RNA酶III，RNA酶D，RNA酶P，tRNA核苷酸转移酶,暨南大学药学院,60,真核生物RNA转录后的加工,rRNA的加工：有5s，5.8s，18s，28s四种，其中5.8s，18s，28s 是由RNA聚合酶I催化一个转录单位（中度重复序列），产生45s rRNA前体，rRNA转录后加工包括前体rRNA与蛋白质结合，然后再切割和甲基化。转录在核仁进行，新生的前体迅速与蛋白质结合成前体核糖体颗粒，然后，其中的RNA经一系列切割先产生18s rRNA，该RNA与蛋白质组成核糖体的小亚基。余下的部分再拼接成5.8S,28S rRNA。,前体rRNA的切割在特殊序列位点，可能是由核仁小RNA(snoRNA)催化。前体rRNA还接受蛋氨酸提供的甲基被甲基化，在切割加工后，甲基化仍保留，甲基化的位点在脊椎动物中是高度保守的。5sRNA 在核质中转录无需加工进入核仁与28s，5.8s rRNA及蛋白质一起组成核糖体的大亚基，以大亚基的形式通过核孔进入胞浆。,暨南大学药学院,61,真核生物RNA转录后的加工,tRNA的加工：包括切除和碱基修饰，有些需要剪接。所有tRNA5端比成熟tRNA多一段序列，由RNaseP切除。有些tRNA基因在反密码环处含有内含子，剪接加工与前体mRNA的加工有所不同：在内含子两端切割去除内含子后将外显子连接，没有转酯反应。,暨南大学药学院,62,真核生物mRNA转录后加工,RNA聚合酶II催化转录，初始产物为核不均一RNA(hnRNA)，新生的hnRNA从开始形成到转录终止，就逐步与蛋白质形成不均一核糖核蛋白颗粒，前体mRNA加工的顺序是形成5帽子结构、内切酶去除3端序列、polyA聚合酶催化形成尾巴；剪接取出内含子变成成熟的mRNA,暨南大学药学院,63,5帽的形成,P348经鸟苷酰转移酶催化与另一个GTP作用在鸟嘌呤7甲基转移酶作用下，以S-腺苷蛋氨酸为甲基来源再经2甲基转移酶催化5帽子的类型,暨南大学药学院,64,前mRNA3端切除及加polyA尾,除组蛋白的mRNA外，真核生物所有的mRNA都有3polyA尾。polyA上游1035bp有AAUAAA序列，下游约50bp有富含GU序列，这2处序列是剪切和加尾所需的信号。,暨南大学药学院,65,mRNA的剪接,剪接splicing几乎所有真核生物的核前体mRNA都有特征的GU/AG序列，称为GU-AG规则。内含子离3剪切点2050bp范围内有一个A也是不变的，称为分支点。分支点附近也有保守序列。,暨南大学药学院,66,剪接过程p350,由核小RNA与蛋白质组成的核小核糖核蛋白与内含子结合，通过snRNA中的U1snRNA与5剪接点互补结合，U2snRNA与内含子分支点序列互补，以及snRNP之间的相互作用，内含子折叠，使内含子两侧的外显子靠近，利于剪接反应的进行。剪接反应通过2次转酯，释放出套索状结构的第一内含子。,暨南大学药学院,67,核mRNA从核内转运至胞浆mRNA在胞浆中的定位胞浆中mRNA的稳定性,第六节 mRNA的转运及其在胞浆中的定位、稳定性,暨南大学药学院,68,核mRNA从核内转运至胞浆,前体mRNA（hnRNA）的加工在核内特定的亚核结构（核基质）中进行。随着新合成的mRNA链延长，不断有hnRNP结合到链上，同时形成剪接体。加工成熟后，去除剪接的蛋白质，但有不少蛋白质结合，形成信使核糖核蛋白mRNP，成熟mRNA以mRNP的形式从细胞核内通过核孔进入胞浆。mRNPs在核内呈盘绕状，当它通过核孔时就呈非盘绕状。,暨南大学药学院,69,核mRNA从核内转运至胞浆,mRNA的5端起导引作用，进入胞浆后即与核糖体结合，牵制住mRNA。5端帽子结构在mRNA从核内转运至胞浆过程的作用是被转运机制识别。mRNP进入胞浆后，与mRNA结合的蛋白质会发生更换，从核内随mRNA转运至胞浆的hnRNP的蛋白质组分解离，重新进入细胞核。组成mRNP的蛋白质组分结合到mRNA链上，特别是在3polyA结合蛋白（PABP），PABP与核内结合在polyA上的结合蛋白（PABPII）是不同的蛋白质。mRNP中蛋白质与RNA的比例比hnRNP中的少。,暨南大学药学院,70,mRNA在胞浆中的定位,胞浆中的mRNA和核糖体一起与粗面内质网的膜紧密结合。结合在mRNA3polyA的PABP又与肌动蛋白微丝组成的细胞骨架结合。某些mRNA3非翻译区有特殊序列指引mRNA在细胞质中的位置。机制不清楚。,暨南大学药学院,71,胞浆中mRNA的稳定性,不同的mRNA稳定性相差悬殊根据功能不同而有所差异，真核生物多数mRNA半衰期可达数小时，调节因子的mRNA只需短时表达，半衰期较短。mRNA的3端非翻译区的AUUUA重复序列是不稳定因素。许多半衰期短的mRNA含有这类序列。mRNA的降解是可以调控的。转铁蛋白受体mRNA的稳定性调节，与其非翻译区铁应答元件IRE重复序列有关。,暨南大学药学院,72,思 考 题,RNA有很多种，它们分别由哪一种RNA聚合酶催化合成？和因子在转录过程中的作用是什么？homework不同RNA聚合酶的启动子有什么特征？RNA聚合酶II催化的转录起始有何特点？homework真核生物RNA转录后加工的内容是什么？真核生物内含子是如何剪接的？核RNA如何转运至胞浆？homework,暨南大学药学院,73,下 课Thank you！,