RNA基本操作技术.ppt

RNA基本操作技术,真核生物的基因组DNA非常庞大，而且含有大量的重复序列，无论用电泳分离技术还是用杂交方法度难以分离到靶基因片段。而cDNA则来自反转录的mRNA，不带有多余序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以较快的分离到相关基因。,RNA基本操作技术,1.总DNA的提取2.mRNA的纯化3.cDNA的合成4.cDNA文库的构建5.基因文库的筛选,1.总RNA的提取,1.1 RNA的种类及特点总RNA包括mRNA,rRNA,tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一个典型的动物细胞中，80%-85%为rRNA、15%-20%为tRNA及sRNA，mRNA约占总RNA的1%-5%。rRNA电泳后的三条特征性条28S、18S和5S是鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。mRNA呈单链状，易受核酸酶的攻击，操作时必须保证实验环境、所用器皿及溶液均无RNA酶的污染。,1.2总RNA的提取方法,1.2.1 Trizol法原理：Trizol试剂使用最广泛的抽提RNA的专用试剂，主要由苯酚和异硫氰酸瓜组成可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来并使核糖体蛋白与RNA分离，还能保证RNA的完整性。,1.2总RNA的提取方法,提取步骤1.用液氮研磨材料，匀浆加入Trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。2.加入氯仿抽提，离心，分离水相和无机相，收集含RNA的水相。3.用异丙醇沉淀，漂洗溶解。,1.2总RNA的提取方法,普通离心柱法原理:含有目的RNA的细胞破碎液通过该柱时，硅胶模对RNA的吸附，使RNA与其他成分分开，在低盐浓度下可从硅胶模上直接洗脱。,1.2总RNA的提取方法,氧化锂法基本原理：采用高浓度尿素变性蛋白，并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA。本法特别适用于从大量样品中提取少量组织RNA，并具有快速简捷的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高、小RNA片段丢失的缺陷。,1.2总RNA的提取方法,提取步骤1.对大量组织或细胞，加入氧化锂-尿素溶液，匀浆器高速匀浆。2.匀浆液在0-4,静置，离心3.取沉淀加入氧化锂-尿素溶液，重复步骤24.加入等体积酚：氯仿：异戊醇，室温静置，离心。5.取上层水相，加乙酸钠-20静置，离心。6.70%乙醇沉淀，真空干燥。7.RNA溶解液溶解沉淀，-70保存。,1.2总RNA的提取方法,用N-P40法基本原理：细胞置于低渗透压下，从外界环境吸水而膨胀，处于易裂解状态。利用表面活性剂乙基苯基聚乙二醇（N-P40）使细胞膜的通透性增强，从而使细胞裂解。,1.2总RNA的提取方法,提取步骤1.细胞（或组织粉末）中加裂解缓冲液（VRC），吹打，冰上静置。2.加NP-40，搅拌，离心，加蛋白酶缓K冲液。3.离心，取上清，加蛋白酶K缓冲液,混匀，37保温。4.加酚，搅拌混匀，室温，离心，取上清。5.加酚：氯仿：异戊醇搅拌，室温，离心，按3,4步再抽提一次。6.取上清，加NaAc和异丙醇，-70 静置。7.离心，弃上清，沉淀用80%乙醇漂洗，离心。8.弃上清，干燥沉淀，溶解沉淀。,1.2总RNA的提取方法,1.2.3 植物组织中RNA的提取方法,1.3RNA浓度和纯度的测定,1.31通过测定其OD260和OD280来判断。OD260为1时相当于浓度为4/ml。如果OD260/OD280在，表示所提取的RNA纯度较好。如果OD260/OD280明显低于1.8，表示样品中可能有蛋白质或酚污染。,1.3RNA浓度和纯度的测定,通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA。电泳后如果rRNA大小完整，而且28S rRNA和18S rRNA亮度接近2:1，mRNA,