PI染色法测细胞周期.ppt
PI染色法测细胞周期,一）细胞DNA含量检测,细胞固定后用PI（Propidium iodide碘化丙啶），染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。,单参数直方图,图中2N代表G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，两者中间代表S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图,DNA细胞周期分析,细胞周期,G2,M,G0,G1,s,200,400,600,800,1000,s,DNA分析,DNA含量,细胞数量,2倍体,异倍体,4倍体,肿瘤组织中的各种DNA倍体,含量与凋亡关系,DNA亚G1峰的检测：利用PI染色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为亚2倍体。,2.凋亡研究,在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，即凋亡峰。检测调亡，可进行抗肿瘤药物研究和某些因素对细胞的损伤机理的研究。,Annexin V Assay,图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死,Date acquired:14-Jan-03File:7Gy 4hr.001Source:dongboDIPLOID:100.00%Dip G0-G1:73.12%at 48.16 Dip G2-M:9.59%at 96.33 Dip S:17.29%G2/G1:2.00 Dip%CV:6.04Apoptosis:13.66%Mean:27.48,图 FCM测试细胞周 期分布和凋亡,根据凋亡细胞的特点来检测,在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏凋亡细胞的FSC？SSC？细胞坏死时，细胞肿胀，FSC？，SSC？,正常人静止体细胞有46条染色体，相当于7.10-12 pg DNA/细胞核，我们称之为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各个时期，DNA含量随各时相呈现出周期性的变化：在G1期，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体；,进入S期后，DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间；当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期，G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期，因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期；一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个子细胞，这两个子细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期(G0期)，而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1，S，G2/M期。,通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1，S及G2/M的百分含量，了解细胞的增殖能力；结合DNA指数分析，还可进行凋亡、异倍体等检测。,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,s,DNA Analysis,DNA content,Count,Normal Cell Cycle,细胞浓度及质量要求,单细胞和核的上机浓度应约106/ml。浓度太低，上机时样本的流速不得不提高，这样就会影响检测的CV。浓度太高，则可能导致染料的相对不足，最终使染色不饱和，同样影响CV和检测结果。制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量：细胞是否聚集或过多的碎片。,染料的选择取决于流式激光的配置。488nm的激光下应用PI(碘化丙啶)，由于PI也与RNA结合，所以分析前样本应用Rnase处理.。重要的是染料要足够，以保证饱和结合。PI的推荐浓度是至少20ug/106 个细胞。其最佳浓度为50ug/106 个细胞。,操作步骤,取一瓶生长期的A549细胞，倒掉瓶中旧的培养液，加入3mlPBS，细胞生长面在下轻轻晃动细胞瓶，然后去掉液体，加入1ml胰蛋白酶消化15分钟（以镜下观察决定）加入5mlPBS轻轻吹打细胞生长面，制成细胞悬液，将细胞悬液移至15ml离心管中1500rpm离心5min，去上清。加入500ulPBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液，在旋涡状态下逐滴加入2ml-2095%冷乙醇，混匀后固定30min。,加入5mlPBS，1500rpm离心5min，去上清液。加入5mlPBS重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清液。加入800ulPI染液，用枪轻轻吹打细胞团，混匀，室温避光染色30min上机检测。,影响荧光染色的因素,温度：温度高于20时，即出现温度淬灭。2、PH：PI在7.27.6，保持荧光染料分子与溶剂间的电离平衡。3、荧光染料浓度：染料太少，结合不完全。染料过多，又会出现浓度淬灭现象。4、固定剂：醛类固定剂会干扰插入性染料与核酸分子的结合，造成荧光发射强度减弱。,
