PCR引物设计方法和原理.ppt

PCR引物设计方法和原理,一、引物设计的目的,获得目标片段DNA测序基因克隆体外转录突变探针设计分子标记,二、引物设计的类型,常规PCR引物PCR同源引物和简并引物探针,引物设计的步骤,下载DNA模板或蛋白质序列进行同源比较，找到保守同源序列设计引物,四、PCR引物设计的原则,引物长度（primer length）:18-27 bp GC钳(GC clamp:引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加3末端碱基（3End Sequence）:Tm 值(melting temperature)：5260 GC 含量（composition）：40-60%,四、PCR引物设计的原则,G 值是指DNA 双链形成所需的自由能(internal stability,用G 值反映):选用3端G 值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G 值相对较高的引物 引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值:超过4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行引物的修饰:一般是在5端增加酶切位点,Breslauer,邻近法的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性,五、简并引物的设计,五、同源引物设计,六、网络免费在线引物设计软件,六、引物设计常用商业软件包,七、Primer Premier和Oligo引物软件使用方法,常有引物设计软件的引物的自动搜索和评价分析 软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以“Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。,