PCR原理及各类PCR仪.ppt
PCR原理及各类PCR仪,PCR原理,PCR全称是Polymerase Chain Reaction，即聚合酶链式反应，是一种用于体外扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，PCR的最大特点，是能将微量的DNA通过复制大幅增加。,PCR技术发展历程,普通PCR（梯度）荧光定量PCR数字PCR,普通PCR（梯度）,简单进行DNA复制扩增，然后可用电泳或者紫外分光光度计进行扩增产物的检测。目的：大量获得复制的DNA产物普通PCR仪（梯度PCR仪）其实就是一台温控仪！关键部件是温控模块！,PCR反应图解和要素,要素1、模板DNA2、dNTP3、Taq酶4、引物5、精确的变化的温度,衡量普通PCR仪的参数（以thermo的Arktik为例）,样品模块规格：960.2ml、3840.03ml、双48孔0.2ml温度梯度范围：1-30升降温速率：3/s温度均一性：0.4（95时）温度精确性度：0.3温控范围：4-99.9热盖温控范围：30-110可调用户界面：反应曲线图显示尺寸重量电压数据交换（USB接口）保质期,PCR仪三种控温方法的区别（calculated、block、probe）,以bio-rad的 PCT-200型PCR仪为例：A）计算控制（calculated）计算控制在运行大多数程序中是最好的温度控制方法，具有较好的温度一致性、可靠性。用计算控制时，仪器通过对样品的管子或玻片热传导的速度和样品体积进行模块温度估算（当运行程序时，这些样品信息都会显示）。因为这种估算是根据已知容量和热力学的规律，所以温度比模块或探针控制更加精确。运行计算控制能缩短实验时间，简短的程序操作能保护酶的活性并减少引物的损失。B）模块控制（block）模块控制与计算控制精度相比较低。在模块控制下，样品温度通常是在模块后才到达设置的温度。这段延迟时间主要是因为管子的类型和样品体积引起的。C）探针控制（probe）通常，探针控制可用于不同的环境中，但是它需要小心使用。探针不能用于微型板和玻片。,市场上主要的品牌和产品,AB：2720、9700、ProFlex、VeritiBio-Rad：MJ Mini、MyCycler、PTC200、PTC240、C1000、S1000Eppendorf：Mastercycler pro S/pro/pro 384,荧光定量PCR,荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，PCR反应过程中，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对起始模板进行定量分析的方法。目的：获得初始模板DNA的浓度。荧光定量PCR仪的关键是温控和荧光激发、检测系统！,如何定量？,Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。,定量原理,确定初始模板的浓度,初始 DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量,荧光定量PCR两种,1、染料法SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光,2、探针法,衡量荧光定量PCR仪的参数（招标）（以AB 7500为例）,1 工作条件：220V电压，10A电源。相对湿度80%。热功率2600W2 技术规格2.1 热循环系统2.1.1加热冷却方式:半导体2.1.2升降温速率:3.5/秒以上*2.1.3 温度范围:4-99.9*2.1.4 控温精确度:0.252.2 样品系统2.2.1样品通量:单管、8联管、96孔板，并无需适配器2.2.2反应体积:10-100ul2.2.3运行时间:2小时2.2.4机械设计:样品无需移动2.2.5 反应后保存:可降温至4保存,2.3 荧光系统2.3.1荧光染料：FAMTM/SYBR Green I,VIC/JOETM,NEDTM/TAMRATM/Cy3,ROXTM/Texas Red,Cy52.3.2荧光校正：软件支持Rox荧光校正去除误差2.4 光学系统2.4.1激发光源：卤钨灯，配备时间监测及自我诊断程序2.4.2滤光系统：五色光源滤光片结合荧光滤光片（630nm-650nm，570nm-590nm，540nm-550nm，510nm-530nm，455nm-485nm）2.4.3检测系统：CCD摄像机一次成像2.4.4检测方式：实时动态检测，动态显示，可同时检测5种荧光染料，必须有520nm，550nm，580nm，610nm，650nm这五块滤光片*2.4.5 实验要求：必须能同时检测FAM、VIC、TAMRA、ROX四种荧光，能进行探针法定量，开展CNV研究,2.5 检测性能2.5.1 检测灵敏度：能检测到10个拷贝数的模板，置信度99.7%2.5.2 线性范围：109以上2.5.3 检测分辨率：99.7%置信度下能有效分辨5000和10000模板拷贝数的差异2.6 分析功能2.6.1 定量量型：能进行绝对定量和相对定量,可同时对无限个数据同时进行分析，比对和作柱形图2.6.3 分析应用：可以进行熔解曲线分析、突变分析、等位基因分析等2.7 软件系统2.7.1定量PCR软件：有绝对定量和相对定量软件*2.7.2 PrimerExpress软件：有，含正版引物与探针设计软件，可进行Taqman MGB探针的设计及合成2.7.3 荧光校正软件：有*2.7.4 拷贝数分析软件：有，含CopyCaller分析软件2.7.5独立相对定量软件：有，可同时对无限个数据同时进行分析*2.7.6 SNP分析软件：有，含AutoCaller分析软件,2.8 试剂盒2.8.1安装试剂盒：有2.8.2 基本试剂盒：原厂家可提供完备的基本试剂盒供选择2.8.3 SNP试剂盒：可提供原厂家500万种SNP检测试剂盒 2.8.4 转基因检测试剂盒：原厂家可提供国际标准的转基因检测试剂盒2.8.5 拷贝数试剂盒：可提供原厂家160万种SNP检测试剂盒并有配套分析模块2.8.6 药物代谢酶分型试剂盒：原厂家可提供药物代谢酶SNP分型试剂盒2.8.7 MicroRNA分析试剂盒：原厂家可提供包含有针对人、小鼠、大鼠、拟南芥、果蝇和线虫的MicroRNA分析产品。2.8.8 基因表达试剂盒：可提供原厂家100万种基因表达检测试剂盒*2.9试剂、耗材：开放式2.10装机指标：99.7%的置信度下分辨5000和10000模板拷贝数的差异,3 基本配置和附件3.1 商用主流计算机及UPS3.2 安装试剂盒和纯荧光校正板3.3 RNASE P校验板3.4 SDS系统操作软件3.5 Primer Express3.0引物和探针设计软件4 选件：无5 资格证明：有ISO9001质量认证，符合CE认证，有医疗器械注册证6 技术服务6.1 安装、调试：需要原生产厂家现场安装调试6.2 培训：需要原生产厂家进行安装培训和售后培训6.3 技术资料：全套安装、操作和维护使用说明书，软件免费更新7 质量保修期7.1 保修期：自验收合格日起整机（包括配件）一年全保，终身维护 7.2 保修点：国内至少三个保修点可提供部件更换，原厂专业维修*8 其他要求：近5年内浙江省定量PCR（须为96孔板标准型配置），用户不少于100个，提供详细清单。,市场上主要的品牌和产品,ABI：7000、7300、7500、7700、7900HT、StepOnePlus、StepOne、PRISM StepOne；2015年新发产品：7300Plus！BIO-RAD：CFX96、iQ5、MyiQ、DNA Engine Opticon 2、Chromo4、MiniOpticon；Stratagene：MX3000P、MX3005P；Roche：LightCycler 480、LightCycler2.0、LightCycler Nano；Eppendorf：Masercycler；,数字PCR,数字PCR即Digital PCR（dPCR)，是一种核酸分子绝对定量技术。相较于荧光定量PCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。应用：1、绝对定量 2、稀有突变检测（传染病研究如HIV）3、转基因检测4、环境样本检测5、单细胞基因表达6、病毒载量鉴定,数字PCR原理,一、油包水法代表品牌：Bio-Rad（QX100、QX200）、Raindance（Raindrop）使用成本：RainDance一个样本反应30-40美元,数字PCR原理,二、芯片法代表品牌：AB（QuantStudio 3D）使用成本：一个反应10美元（芯片+耗材）,视频资料QuantStudio3D 数字PRC系统,
