miRNA研究策略及技术.ppt
,miRNA研究策略及技术,RNA干扰,RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指一种由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。microRNAs(miRNAs)：mRNA翻译被抑制short interfering RNAs(siRNAs)：引起mRNA切割,干扰机制,miRNA简介,microRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由2125个核苷酸组成。通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制调节基因的表达。动物的靶序列在3非编码区（3UTR）植物的靶序列在编码区或5UTR,miRNA生成,miRNA途径开始于一个miRNA基因的pri-miRNA（primary miRNA）转录本；这个70100nt的发卡RNAs（pri-miRNA）在核内被核糖核酸酶Drosha加工处理而最终成为pre-miRNA（precursor miRNA）pre-miRNA被核输出蛋白exportin 5转运入胞质，接着被第二个核糖核酸酶Dicer消化为2125nt的miRNA；这个阶段的miRNA可以结合RISC（RNA-Induced Silencing Complex）并与靶标mRNA互补图例,miRNA研究流程,miRNA的筛选,深度测序 抽提分离小分子(例如18-30nt)RNA，通过RT-PCR扩增之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA表达谱。深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA(miRNA-known)、新的miRNA(miRNA-new)以及可能的新miRNA(miRNA-cadidate new)，并对新发现的miRNA进行靶基因分析，功能预测等。,miRNA芯片 利用miRNA芯片，可以高通量分析miRNA表达的时空特异性、不同样本(例如癌组织和癌旁组织)中miRNA的差异表达，寻找在生物学功能上起作用的miRNA,实例：,miRNA表达检测,目前检测miRNA的技术主要有以下几种：Northern杂交原位杂交微点阵（microarray）实时定量PCR,Northern杂交,实例：,原位杂交,实例：,实时定量RT PCR,Loop反转录法每次RT只能检测一个miRNA特异性高多个样本中检测同一miRNApolyA加尾法一次RT可检测所有miRNA通用性高适合miRNA高通量检测,引物设计,1.通常情况下，Forward Primer序列与待测miRNA序列基本一致，只要将原有的U替换成T即可。例如：,2.在特殊情况下，例如当miRNA分子中GC含量偏高时，可在miRNA序列3端减少34个碱基，从而降低引物的Tm值；相反，如果miRNA分子中GC含量偏低时，可在miRNA序列5端添加几个GC碱基，从而提高引物的Tm值。例如：,*1 OLIGO:Primer Analysis Software。*2 Primer3:（）,实例：,miRNA功能研究,用特定试剂改变内源miRNAs的水平，观察靶mRNA及编码蛋白的表达，进行信号通路研究功能获得研究：把miRNA导入细胞miRNA mimics：化学方法合成的miRNA模拟物miRNA 表达克隆功能缺失研究：抑制miRNA表达miRNA inhibitormiRNA抑制剂表达克隆,过表达miRNA,将miRNA mimics转染到细胞中，能实现miRNA瞬时过表达构建miRNA表达载体可进行长期研究过表达载体中有插入成熟miRNA、pre-miRNA及pri-miRNA序列三种形式载体选择有三种：慢病毒，腺病毒，质粒,抑制miRNA,miRNA 抑制剂克隆导入细胞后表达的miRNA抑制剂(miArrest)特异地结合它们的靶miRNA，形成稳定的复合物，阻止了miRNA对靶标mRNA的降解或者翻译抑制，上调miRNA靶标基因的表达,化学合成的miRNA抑制剂是序列特定的、单链寡核苷酸分子，适合瞬时转染,miRNA靶基因的寻找,miRNA的靶基因的寻找主要通过利用生物信息学方法和生物学实验方法。生物信息学方法主要是利用某种算法对靶基因样本进行评分及筛选。为了得到更为可靠的靶基因预测，通常综合多个预测方法，取其共同预测的基因作为研究重点。,常用miRNA靶标数据库,miRbase：microRNA基因注释数据库。目前只提供了microRNA的靶标的预测软件的链接（如：PicTar）。网址：http:/mirbase.org/index.shtmlTarbase：一个收集已被实验验证的microRNA靶标数据库。网址：http:/microrna.gr/tarbase/targetScan:基于靶mRNA序列的进化保守等特征搜寻动物的microRNA靶基因。是预测microRNA靶标假阳性率较低的软件。网址：http/PicTar：基于microRNA或microRNA靶标联合作用等特征开发的搜寻动物的microRNA靶基因的软件，假阳性率也较低。网址：,实例：,miRNA靶基因的鉴定,利用荧光定量PCR及Western blot方法分别检测转染或敲除miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化,从而确定miRNA与靶基因的对应关系。,miRNA靶位点的鉴定,荧光素酶报告基因法基本原理是首先构建荧光素酶表达载体,将希望鉴定的miRNA靶基因的3UTR构建到荧光素酶基因的3UTR中,然后将荧光素酶基因表达载体,转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平，最后检测荧光素酶的表达情况以分析转染3UTR中是否含有miRNA的靶位点。,荧光素酶报告系统,双荧光素酶报告基因测试 结合萤火虫和海肾荧光素酶的共报告基因测试技术,多克隆位点,技术流程,获得miRNA对应DNA模板扩增含有靶位点的3UTR序列靶序列克隆，构建到荧光素酶表达载体PCR产物双酶切，连入同样双酶切的载体中，连接产物转化DH5，阳性克隆鉴定。荧光素酶活性检测将miRNA mimics以及荧光素酶报告共转染，检测荧光素酶报告基因将3UTR靶位点的种子区进行点突变作为对照，使结果更严谨,实例：,实例：,miRNA调节通路的检测,蛋白芯片Western blot,实例：,
