miRNA讲稿徐和学生用.ppt
miRNA简介,miRNA定义：,微小RNA(microRNA，miRNA)是一种长度约为22-28 nt的非编码小分子RNA，miRNA通过与靶mRNA 3UTR(Untranslated Regions,即非翻译区，是mRNA分子两端的非编码片段)完全或不完全的互补结合，导致靶mRNA降解或翻译抑制，从而调控靶基因的表达，影响细胞增殖、分化和凋亡.它们通过miRNA介导的特异性的基因沉默导致靶mRNA降解及抑制蛋白质的合成调控转录后基因表达水平。miRNA对细胞的增殖、分化和凋亡有重要的调节作用。,miRNA定义：,在基因组中有被翻译成蛋白质的区域也有非翻译的区域而翻译区域仅占全基因组的1 4。为何存在大部分非翻译区域呢？m i R N A 是来自非翻译区域的单链R N A，存在于细胞内部。是基因调控的重要分子。,miRNA*定义,RNase-III酶Dicer将pre-microRNA剪切成不完全配对的双链RNA双体（miRNA:miRNA*),即成熟microRNA和其互补序列所组成的二聚体，起作用的是miRNA,选择性整合RISC中设别靶基因而起作用，而miRNA*会降解。,miRNA和siRNA区别,把疾病相关R N A 作为靶点的药物中，s i R N A 药物15个已经进入实质性的临床研究。s i R N A 为双链R N A，具有与靶点R N A 互补的结构，完全互补靶向抑制基因表达，长度与m i R N A类似，约为19-25 个碱基对。s i R N A 在体内由酶解旋为单链 与靶点mR N A 结合后降解。s i R N A 和m i R N A 都会抑制m R N A 向蛋白质的翻译 但是其作用方式却差别颇大。,一般认为siRNA 的特异性很高 不会发生结合于非目标mR N A 的脱靶情况(off-targeting)。但是 研究发现miRNA的结合能力存在摆动 1 个miRNA可抑制多个mRNA 的功能。研究人员预测在miRNA 靶点药物开发方面,这一特点具有重要意义,因此miRNA的作用效果可能更高，但是作用机理更复杂，对基因调控的网络作用往往难以研究清楚。,miRNA作用方式,miRNA对其功能靶点的最低要求是，至少7个碱基与5端互补结合，就可调控其靶基因。miRNA与靶mRNA的作用方式有两种。当两者完全互补时，miRNA的作用方式与RNA干扰相似，即与完全互补的同源mRNA配对结合，导致靶mRNA降解。而当miRNA与靶mRNA不完全互补时，miRNA则通过与靶mRNA的3端非翻译区结合，阻遏转录后翻译。由于许多miRNA与靶mRNA并不完全互补，所以主要的作用模式是转录后的翻译阻遏（调控）。,张辰宇:吃什么补什么,发现植物的微小核糖核酸（microRNA）可以通过日常食物摄取的方式进入人体血液和组织器官。并且，一旦进入体内，它们将通过调控人体内靶基因表达的方式影响人体的生理功能，进而发挥生物学作用。这一研究成果公布在Cell research杂志上。生物通 这一研究成果公布后吸引了媒体关注，美国大众科学网站对此也进行了报道，称研究人员发现蔬菜里的核糖核酸(RNA)在食入后会进入体内循环的血液，而且一旦进入我们体内，就能改变我们的基因表达。证明植物miRNA可能是食物中的“第七种营养成分”（其他六种分别是水、蛋白质、脂肪酸、碳水化合物、维他命和稀有元素）；,张辰宇:微小RNA的人体之旅,在实验中，研究人员给小鼠喂的是生米，而人类日常进食吃的是熟米，食物经过加热之后是否会破坏其微小RNA呢？张辰宇指出，煮过的米饭中仍然含有很多微小RNA，经过油炸才能破坏掉大部分的微小RNA。他们还发现，中药在经过煎煮之后，药汤里的微小RNA的浓度很高。给小鼠喂药之后24小时，就发现小鼠肺部相应的微小RNA浓度增高。他们认为，这些发现为在传统的中草药中发现一类全新的活性分子提供了依据。对于生物学来说，更大的意义可能在于，这些研究为我们理解跨“界”的相互作用提供了新的线索。“动物、植物之间如何的借着微小RNA互相调控的？大家说不定共进化（co-evolution）了。”张辰宇说。,miRNA网站,miRNA发挥对约3 0 人类蛋白质的表达调节作用。序列分析表明，至少有1/3的人类基因与miRNA调控相关，而且越来越多的试验证据表明，miRNA还有很多功能未被发现。MiRNA最早在1993年在线虫体内发现。迄今在人体已经发现并命名的miRNA 超过了1万 个。除了早期发现的let一7等保留命名外，一般命名为miR-数字。见网站：,starBase：一个高通量实验数据CLIP-Seq（或称为HITS-CLIP）和mRNA降解组测序数据支持的microRNA靶标数据库，整合和构建多个流行的靶标预测软件的交集和调控关系。网址：,Tarbase：一个收集已被实验验证的microRNA靶标数据库。网址：http:/microrna.gr/tarbase/miRecords：一个整合的microRNA靶标数据库。整合多个靶标预测软件的调控关系。网址：targetScan:基于靶mRNA序列的进化保守等特征搜寻动物的microRNA靶基因。是预测microRNA靶标假阳性率较低的软件。而且是microRNA领域大牛Bartel实验室开发的。网址,PicTar：基于microRNA或microRNA靶标联合作用等特征开发的搜寻动物的microRNA靶基因的软件，假阳性率也较低。是microRNA领域大牛Rajewsky实验室开发的。该文章位列miRNA相关文章引用Top5。网址：PITA：基于靶位点的可接性（target-site accessibility）和自由能预测microRNA的靶标。是著名的生物信息学家Segal实验室开发的。网址：,RNA22：基于序列特征预测microRNA的结合位点。是几个流行的microRNA靶标预测软件的其中一个。IBM公司的研究团队开发的。网址：miRanda和microRNA.org：是著名的Memorial Sloan-Kettering 癌症研究中心的研究人员开发的软件和数据库。miRanda的最新版本又叫mirSVR。网址：,MicroCosm：EMBL-EBI的Enright 实验室开发的microRNA靶标数据库。网址：miRTarBase：整合实验证实的microRNA靶标的数据库。网址：,miRGator v2.0：整合microRNA表达、靶标和疾病相关信息的数据库。网址：MiRNAMap:动物的microRNA基因及其靶标的数据库。网址：miRDB:动物microRNA靶标预测和功能注释数据库。网址：,RNAhybrid：一个基于miRNA-target配对自由能预测microRNA的靶标的软件。网址：miRGen：microRNA基因和microRNA靶标数据库。网址：,m i R N A与肿瘤研究,m i R N A 的研究普遍集中于监测肿瘤的发生发展和靶向肿瘤治疗。(1)m i R N A 在肿瘤的发生发展中具有重要的作用，参与了肿瘤发生发展的各个阶段。结肠癌发生发展的各个阶段，经历了不典型增生、腺瘤、癌及肿瘤转移等一系列变化，每一个阶段都有相应的基因发生改变，同时也有调控这些基因的m i R N A 发生变化。事实上，m i R N A 与基因之间相互调控，共同突破平衡，才导致肿瘤的发生发展。作为肿瘤发生的重要信号通路。,m i R N A与肿瘤研究,(2)m i R N A 具有很好的组织特异性。经筛查检测4 8 个m i R N A 确定肿瘤的组织来源准确率达9 0。(3)m i R N A 具有肿瘤发生的阶段特异性，同一种肿瘤在发生发展不同分期阶段具有不同的m i R N A 表达谱。(4)m i R N A 分子较小，在石蜡包埋的组织中较m R N A 更为稳定，对于石蜡保存的组织检测m i R N A 将更为准确。(5)最近有报道证实血清或者血浆中游离m i R N A 也是有价值的肿瘤监测指标，能够稳定地被检测并且提示肿瘤状态，使m i R N A 作为新的肿瘤标志物具有较好的应用前景。,m i R N A与肿瘤研究,部分肿瘤与miRNA变化（2倍高，0.5低）,A549/T与A549细胞miRNA芯片的qPCR验证,miRNA在肿瘤治疗中的希望,miRNAs在肿瘤发生发展中所起的重要作用给新型抗癌药物的开发带来了希望。改变肿瘤中miRNAs的表达量被视为一种新的治疗策略，主要包括引入抑癌基因性miRNAs、敲除或削减癌基因性miRNAs,早期发现的miRNA,miRNA可以作为肿瘤抑制因子或者癌基因，在癌症中发挥其功能，let一7在肺癌中表达降低，是肿瘤预后较差的生物标记。在体外转染let一7g可以抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞死亡。在免疫缺陷小鼠体内，let-7g可以抑制肿瘤形成。let-7对一些癌基因(如Kras、HMGA2)以及抑癌基因(如BRCA1)均可起到重要的调节作用，miR-200在肿瘤表达低，生存率低，表达高，生存率高。,作为肿瘤抑制因子,miR一122可以抑制癌细胞的某些特性，例如克隆存活、不依赖支持物生长、转移、侵袭、上皮-间质转化、裸鼠成瘤。这些结果表明，在肝脏中miR-122作为肿瘤抑制因子行使其功能。在体外miR-122可以直接抑制内皮细胞生成血管。在鼠肝细胞癌模型中，证实了miR-122以ADAM17为靶点发挥其抑瘤活性。,作用机理,miR-143和miR-145在结肠腺瘤形成早期，表达下调，促使腺瘤形成。对其3端突起处进行化学修饰，使其活性增强、抵抗核酸酶。这种经化学修饰后的miR-143复合物可以抑制人DLD一1结肠癌细胞移植瘤形成，有可能成为治疗结肠癌的RNA药物,作为癌基因,m i R-2 1 是目前唯一的在几乎所有肿瘤中表达上调的m i R N A，其参与了肿瘤细胞的增殖、迁移、浸润以及肿瘤的血管生成等多个环节，并且在体外已经证实与多个抗肿瘤药物的敏感性有关。目前认为，m i R-2 1 调控肿瘤细胞的多种药物敏感性的机制主要与m i R-2 1 参与调控细胞周期，抑制细胞凋亡有关。迄今为止，m i R-2 1 比较明确的靶分子有P T E N、P D C D 4、M a s p i n、T P M I、N F I B、R E C K、S P R Y 2 及M A R C K S 等。,作为肿瘤诊断,用miRNA作为分子标记作为肿瘤的诊断准确率达90。仅用1个miR-205指标来区分肺鳞癌及非鳞癌的敏感性就达96，特异性达90。在实际应用方面，miRNA的表达水平可以从石蜡包埋的肿瘤组织、血清、胸腹腔积液，甚至痰液中检测，应用范围广，甚至可以实现无创检测，符合人们对理想分子标志的所有要求。,经典的miRNA合成途径,miRNA 可能来自于基因组的基因间隔区或者编码基因的内含子中。首先在细胞核内编码miRNA 的基因通过RNA 聚合酶II 或RNA 聚合酶III 转录生成初级miRNA(pri-miRNA)，pri-miRNA与来自蛋白质编码基因mRNA相似，有5 端帽式结构和3 端多聚腺苷酸尾结构，长度可达数千个碱基。接着p r i-miRNA 在一种RNaseIII(Drosha 酶)和它的伴侣分子(DiGeorge syndrome critical region gene 8,DGCR8)组成的复合物作用下，剪切为7080 个核苷酸长度、具有茎环结构的miRNA 前体(pre-miRNA)。,作用机理,miRNA 前体在Ran-GTP 依赖的核质/细胞质转运蛋白输出蛋白5(exportin 5)的作用下，从核内运输到胞质中。随后miRNA前体在另一种RNaseIII(Dicer酶)的作用下被剪切成21-28 个核苷酸长度，而且其5端磷酸化和3端有2 nt 的悬垂序列，类似于siRNA 的不完全配对的双链RNA，它们是由成熟miRNA与miRNA*组成的二聚体，miRNA*是pre-miRNA中的一段RNA，其位置恰好与成熟的miRNA 相对。最后在RNA 解旋酶作用下生成成熟miRNA 和miRNA*，成熟miRNA结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencingcomplex,RISC)中发挥作用，miRNA*则被降解。,推测,mirtron途径,在无脊椎动物和哺乳动物中发现一种不依赖Drosha酶而产生miRNA的新途径,即mirtron途径。该途径的发现为进一步解释miRNA的产生机制提供了重要资料以及新的研究思路。,疾病治疗,研究基因的功能通常是将其从基因组中敲除，然后观察敲除前后的变化，但在破译miRNA的功能，一般不会采用这种策略，而是通过增强或减弱该miRNA的表达来鉴定其功能。miRNA mimics是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。miRNA mimics进一步增强内源miRNA的沉默作用，降低细胞内靶向蛋白表达量，进行功能获得性（gain-of-function）研究,疾病治疗,miRNA inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂。近年来人工合成的miRNA（artificial miRNA，amiRNA）已经成功应用于沉默预期靶基因的表达及其功能研究，人工合成的miRNAs既能够特异性地沉默单一基因，也可以同时沉默多个相关但不相同的基因。miRNA inhibitors，特异的靶向和敲除单个的miRNA分子，可以削弱内源miRNA的基因沉默效应，提高蛋白表达量，,反义技术：miR21:5-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3反义DNA:5-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3硫代、氟代、甲基化等修饰，L2000转染。动物实验。同以往的反义寡核苷酸技术类似。,反义药物,抑制过高表达的miRNA时，使用互补核酸的反义药物非常有效。主要在修饰上，用硫代、氟代、甲基化等修饰，也有用锁核酸BNA(bridged nucleic)人工核酸将反义药物的2位和4位碳通过桥结构连接而抗核酸酶分解。同基因的反义药物类似，不同的是miRNA反义药物是靶向miRNA正义链。,首个在人体中试验的miRNA药物,病毒中同样发现了基因编码的miRNAs，病毒miRNAs在蛋白质编码基因中所起的调节作用可能是在病毒中维持复制、逃逸宿主免疫等。文献报道，miR一122与靶基因的5-UTR相结合，可以促进丙型肝炎HCV的复制，目前已经开发miR-122作为抗病毒治疗靶点，丹麦制药公司Santafis Pharma宣布其开发的丙型肝炎新型治疗手段SPC3649(锁核酸LNA-antimiRTM-122)开始进入人体第一阶段临床试验，这是世界上首个在人体中试验的miRNA药物。,miRNA药物,2008年5月28日，丹麦制药公司Santaris Pharma的SPC3649为世界上首例miRNA药物进入临床研究，作用靶点为miR-122,为丙型肝炎药物，miR-122是肝细胞中表达高的miRNA，与丙型肝炎病毒增殖有关。48例健康人参与了I期临床试验。2009年葛兰素史克和美国Regulus公司合作进行反义抑制miRNA靶点药物研究，合同金额6亿美圆。,前景,siRNA药物出来后，对原来专一性反义抑制靶基因的反义药物（例如抑制Bcl2基因的G3139）研究认为没有放大效应，抑制效果有限。认为siRNA药物的靶向性也好，不会出现脱靶效应，并且有放大效应，比反义药物作用敏感。但是同miRNA药物比较，miRNA的结合能力变化大，1个miRNA可以抑制多个甚至几十个mRNA的功能，因此认为miRNA靶点药物的特点是1个靶点可能将该类疾病的相关因子一网打尽，因此可能比siRNA药物具有更高的有效性。,同Bcl2相关的目前进行比较多的研究是过表达miR-181,145,15a,15b,16,34,或用反义抑制21,肿瘤耐药性,胃癌细胞系SGC7901和长春新碱耐药细胞比较，后者24个miRNAs下调2倍以上，11个miRNAs 上调2倍以上。Q-RTPCR进一步证明miR-181s下调4倍。耐药可能通过miRNAs水平改变调节引起，CDDP引起卵巢癌细胞的let-7e,miR-30c,miR-25b,miR130a,miR335的不同表达水平变化，认为这6个可能相关于耐药。,肿瘤耐药性,胃癌细胞系SGC7901和长春新碱耐药细胞比较，后者MDR表达增加，miR-181b下调，Bcl2表达增加。高表达miR-181b使MDR表达增加下降，Bcl2蛋白水平下降，miR-181b的Q-RTPCR表达增加，对化疗药物敏感性增加和凋亡敏感性。耐药可能通过miRNAs水平调节改变，CDDP引起的卵巢癌细胞let-7e,miR-30c,miR125b,miR-130a,miR335等不同表达水平变化，认为这6个miRNAs同耐药直接相关。实际可能有相当多的miRNAs参加化疗耐药的影响，调节部分miRNAs可能增加化疗耐药的敏感性。,cardiac fibroblasts directly to cardiomyocytesCirculation Research published online April 26,2012,心肌成纤维细胞-心肌细胞在实验室器皿中首次将实验鼠心脏病发作后留下的疤痕组织变成心肌细胞。最新研究一旦在人类身上试验成功，将有助于科学家们研发出新的心脏衰竭疗法。,研究小组成功利用诱导性多能干细胞（iPS细胞）人工制成癌干细胞并在小鼠身上得到验证,日本京都大学研究小组将Oct3/4,Sox2,c-myc,klf4通过逆转录病毒载体转入小鼠的成纤维细胞，把成纤维细胞变成类似胚胎干细胞的多能干细胞，并将其命名为iPS.,研究一般方法,miRNA表达低，转染过表达方法：（1）载体方法，慢病毒方法（2）miRNA mimics模拟物，成熟sense，Antisense 为两条合成，不完全配对，文献miR-181b，成熟sense连模拟物为一条链，单链，可以委托合成，有现成库，成熟sense，Antisense在找到，成熟sense就为红色区，Antisense则在后面2个不配对区改成配对，并且链用3-benzen-pyridine(BP)修饰。已进行动物实验（文献miR143）,抑制相关基因表达,siRNA与miRNA药物不同,1、根据mRNA序列，写出siRNA,aiRNA序列及可能的修饰方式：GUGGGACUUUGGAAAUACA2 miR-181b序列是:5-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU-3，设计出反义药物序列和miRNA药物可能的序列和修饰方式,结论,miRNAs的发现无疑是对现有真核生物基因表达调控的补充，其在基因调控及生物发育中的作用正在被不断研究并开发。miRNAs在体内不仅作为功能分子发挥作用，还参与并决定基因表达调控、蛋白质翻译，从而影响细胞代谢等所有生命进程。,结论,由miRNA介导的RNA干扰技术正迅速从基础研究领域迈进临床应用，相信不久的将来将有越来越多的RNA干扰药物进入临床研究和应用。循环miRNAs作为一种无创性检测手段在疾病的早期诊断和预后中也展示出广阔的应用前景。相信不久的将来将有越来越多的临床检测得到应用。基础研究方面的基因调控网络的论文将越来越多。,结论,虽然miRNAs在疾病发生发展过程中的作用是“因”还是“果”仍需更多研究来证明，但可以认为对miRNAs的深入研究推动了从RNA、DNA和蛋白质三大生物分子方面对疾病进行预测、诊断和治疗的进程。,结论,但是siRNA、miRNA的RNAi技术真正能应用于日常生活虽然为时尚早，还需要科学家们进一步广泛深入细致持久的研究。尽管如此，我们依然可以预测，与其它基因技术一样，siRNA、miRNA的RNAi技术将在不久的将来会在基因治疗和基因应用中发挥极大的作用，并将给整个生物理论带来巨大而深远的影响,lncRNA定义,定义：长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)，长度在200-100000 nt之间的RNA分子，不编码蛋白，lncRNA参与细胞内多种过程调控。北京大学的研究人员在世界上首次创建并发布了长非编码RNA疾病数据库（lncRNA and disease database,LncRNADisease），收录了160多种和长非编码RNA有关的疾病，并集成了一个生物信息学工具用以预测新的人类长非编码RNA和疾病的关系，收录了有实验支持的9445条记录，包括396种人类疾病（2012年9月份数据）。公布在Nucleic Acids Research杂志上。lncRNA作为疾病分子标记物、疾病发生发展中和药物靶点的潜力研究,新型长非编码RNA，命名为sno-lncRNAs,一般认为，外显子-mRNA，而内含子-降解，没有生物学功能。中科院生化细胞所陈玲玲证实了一类双末端都含有小核仁RNA（snoRNA）的内含子序列在剪接发生过程中，可以形成一类新型长非编码RNA，命名为sno-lncRNAs（Long Noncoding RNAs with snoRNA Ends），具有重要生物学调控功能。人类疾病PWS综合征（即小胖威利症）紧密关联区域存在5个sno-lncRNAs，它们在人源胚胎干细胞中表达量极高，且异常稳定。功能研究表明，这些sno-lncRNAs加工成熟后形成一种全新的细胞核亚定位；它们同时还含有多个剪接调控因子Fox2蛋白的特异结合位点，调节Fox2在细胞核内的分布，进而影响Fox2对特异mRNA底物的选择性剪接调控。sno-lncRNAs存在表明真核细胞转录组表达调控多样性,pi RNAs,piRNA最早是科学家们当时在对无脊椎动物和小鼠中对精子细胞发育过程中起重要作用的Piwi蛋白进行分析时，发现这种蛋白质上附着了一类新的RNA，因此将这类新RNA命名为“PIWI互动RNA”（简称pi RNAs）。piRNA大小约为2930个核苷酸或2631个核苷酸左右。piRNA的发现被美国科学（Science）杂志评为了2006年十大科学进展之一。推测piRNA可能在表观遗传水平和转录后水平沉默转座子、逆转座子等DNA移动元件。,
